生物探针在DNA损伤检测中的应用研究

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DNA是机体生命活动最重要的遗传物质,其分子结构完整性和稳定性的保持对于细胞的存活和正常生理活动的发挥具有重要意义。外界环境因素造成的DNA损伤以及基因本体在复制后修饰过程中出现的异常会导致肿瘤、胚胎发育障碍等多种疾病,对DNA损伤的研究也越来越具有生物学意义。因此建立准确性好、灵敏度高、操作简单的DNA损伤检测方法可以为某些疾病的早期预防和诊断提供重要的依据。本文围绕DNA损伤开展了如下两方面的工作:  DNA发卡结构通常是由分子内双链碱基间的沃森-克里克氢键作用力形成的。本论文研究内容之一是利用基于银离子调节的C-Ag+-C作用力形成的分子信标来检测DNA损伤。这种金属离子调节形成的探针DNA较传统的发卡型结构探针更灵活,更易变换结构。在此基础上,我们结合DNA链置换反应设计了一种简单,快捷检测DNA的方法。这种方法能够灵敏检测DNA,特异性强,可以区分单碱基错配,并成功运用于检测一些有毒化学试剂,如氧化苯乙烯和亚砷酸钠引起的DNA损伤。  传统的甲基化检测方法如凝胶电泳,操作繁琐且耗时。本文中,我们发展了一种基于氧化石墨烯和限制性内切酶HpaⅡ的荧光检测DNA甲基化的新方法。HpaⅡ能够特异性识别切割双链序列5-CCGG-3。末端修饰FAM的探针DNA和目标DNA杂交形成双链DNA,探针DNA比目标DNA多10个碱基。通过调节氧化石墨烯的浓度使得双链DNA未能完全脱离氧化石墨烯表面,此时荧光仍然被猝灭。但是当加入限制性内切酶HpaⅡ后,HpaⅡ特异性识别双链5-CCGG-3序列并且切割,形成修饰FAM的小片段DNA,这些修饰FAM的小片段DNA则不会依附在氧化石墨烯表面,荧光恢复。如果用甲基化转移酶(M.SssⅠ)、二甲亚砜(DMSO)和乙醛(CH3CHO)处理DNA后,体系荧光无法恢复。据此,可建立DNA甲基化的荧光检测新方法,该方法简单,快速,有效,在甲基化酶抑制剂药物筛选方面有很大的应用潜力。
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