论文部分内容阅读
[目的]阿尔茨海默病是一种起病隐匿的神经系统退行性病变。临床上对AD疾病的预防和治疗至今仍然缺乏有效的药物和方法。Aβ在AD的发病过程中占据着核心地位,但是Aβ寡聚化同时又与tau过度磷酸化、神经炎症、氧化应激等病理反应之间存在着交错复杂的相互作用。这种AD疾病机制的复杂性给其治疗药物的研究带来了巨大的困难。单纯以Aβ为靶标的干预手段,在临床上都没有能够成功逆转AD的病情。有研究表明,多酚类的化合物如阿魏酸、表儿茶酚等可抑制炎症反应,具有神经保护作用。金荞麦是一种富含多酚类成分的药用植物,其中含有丰富的原花青素、阿魏酸、没食子酸、儿茶酚、表儿茶酚等物质。在我国,金荞麦是一种常见的民间用药,具有抗癌、抗炎、提高免疫力、降脂和降低血糖等多种药理学活性,但对于金荞麦的神经保护作用目前尚未见有研究报道。为此,本研究中提出关于FDE作用的假说:FDE可与Aβ直接作用,抑制后者的聚集并拮抗其神经毒性作用,同时可抑制AD发病过程中的炎症反应,减轻Aβ对大脑的病理损伤,从而对AD动物模型实现有效的干预作用。本研究的目的旨在确定这一假说内容的真实性。[方法】应用反相高效液相色谱分析确定FDE中多酚类的成分及其比例。用硫磺素实验和透射电镜实验同时来验证FDE对Aβ聚集的抑制作用,应用MTT的方法在SH-SY5Y细胞中观察FDE对Aβ神经毒性的作用。利用APP/PS1双转基因小鼠的AD模型进行动物实验。在小鼠3月龄时开始按给药方案喂饲,共持续9个月。小鼠分为3个组:FDE给药组(APPSwe/PSldE9转基因小鼠,N=12,FDE和普通饲料相混)、AD对照组(APPSwe/PSldE9转基因,N=12,普通饲料)以及一个WT对照组(同窝野生型小鼠,N=12,普通饲料)。每组12只小鼠，雌雄各半。通过观察动物体重变化和ALT、AST含量,确定FDE长期给药的安全性。通过预防性给药,观察Aβ对AD的干预作用。给药完成后,进行Morris水迷宫实验，测试大鼠的空间学习记忆能力。为确定FDE对脑中Aβ沉积的作用,我们用Aβ抗体6E10进行免疫组化实验,用刚果红对Aβ斑块进行染色。各组小鼠血浆和大脑(经SDS及甲酸分别提取)样本的Aβ含量水平,用ELISA试剂盒进行检测。对脑切片进行含铁血黄素的染色来检测脑中(主要观察皮层区、海马区和丘脑区域)的微出血。应用单克隆抗CD45抗体检测皮层区和海马区的小胶质细胞,用兔抗胶质纤维酸蛋白抗体检测星形胶质细胞。用ELISA试剂盒检测血浆中的TNF-α IL-1β、IFN-y的含量。[结果】HPLC检测结果显示,在FDE中含有7种多酚成分:1没食子酸;2原儿茶酚;3儿茶酚;4没食子酸酯二聚体;5表儿茶酚;6没食子酸酯三聚体;7表儿茶酚没食子酸酯。电镜检测的结果显示,Aβ纤维可被FDE分解。硫磺素T荧光检测发现,在FDE存在的条件下,Aβ片段难以聚集形成长的纤维,且这一作用呈剂量依赖性。FDE对体外培养的SH-SY5Y的细胞活性没有影响,.但Aβ寡聚体的细胞毒性作用可以被FDE抑制,且这一作用具有剂量依赖性。经长期喂食,FDE对小鼠体重没有明显影响,ALT和AST含量没有明显变化。水迷宫实验的行为学研究表明,隐藏跳台后的六天里各组小鼠的逃逸潜伏期、游泳距离、游泳速度没有明显差异。探索平台实验显示,FDE组小鼠的潜伏期有所减短,但各组小鼠的潜伏期没有明显差异。小鼠脑切片经免疫组化实验和刚果红染色,发现FDE显著减少脑中Aβ斑块的负荷。ELISA检测表明,和对照组相比,FDE组转基因小鼠大脑中总的Aβ含量明显降低,Aβ-SDS部分和Aβ-FA部分也分别减少,均有显著性差异。对Aβ40和Aβ42的含量分别进行检测,同样发现,经FDE治疗后SDS中的Aβ40和Aβ42、FA中的Aβ40和Aβ42以及总Aβ40和Aβ42水平都显著下降。FDE组血浆中的Aβ含量也减少了。同时,FDE可以显著抑制AD小鼠脑中的微出血。应用单克隆抗CD45抗体检测皮层区和海马区的小胶质细胞,FDE组的小胶质细胞比同基因型对照组明显减少。经GFAP染色显示,食用含有FDE饲料的小鼠脑中的星形胶质细胞和食用普通饲料的小鼠的相比明显减少。ELISA结果表明,促炎症因子TNF-α在FDE组明显低于对照组,IL-1 β和IFN-γ没有明显变化。[结论]FDE对Aβ纤维形成具有抑制作用,而且FDE能够拮抗Aβ的细胞毒性作用。FDE毒性小,适合长期食用。对AD小鼠的行为学研究表明,FDE对AD小鼠的学习记忆能力有提高的趋势,但显效略缓。经预防性给药后,FDE能够显著减少AD小鼠脑内Aβ斑块的数量,可以降低体内的Aβ42和Aβ40的含量。同时,FDE也减轻了 Aβ对血管的损害,使脑中微出血的倾向明显降低。FDE对神经炎症反应也有一定的抑制作用,可抑制AD小鼠中反应性小胶质细胞和星形胶质细胞的增生,并显著降低炎症因子TNF-α的含量,但对IL-1β和IFN-γ没有明显改变。