转基因的转录后基因沉默是由于转基因在转录水平能正常表达，但转录后的RNA在细胞质中发生了序列特异的降解而导致在蛋白质水平表达的沉默，转入非翻译的病毒编码的基因，可以使植物也发生针对病毒基因序列的特异的基因沉默，从而导致对入侵病毒的RNA的降解，这种抗性称之为 RNA介导的抗性。而且越来越多的报道表明，双链RNA（double strand RNA,dsRNA）极可能是转录后基因沉默的起始因子。 本研究室已用完整的马铃薯Y病毒的外壳蛋白（Coat Protein,CP）基因作材料构建了非翻译的植物表达载体并且获得了高度抗病的转基因烟草植株，分子杂交结果表明抗病性是由RNA介导的，因此在此基础上本研究的第一个内容试图用马铃薯Y病毒的CP基因的一部分序列即短片段作为转基因材料，探明马铃薯Y病毒CP基因的缺失片段是否也可导致转录后基因沉默从而诱导抗病性，该研究的意义在于可以在有限长度的转基因序列中包含更多的不同病毒来源的基因序列，为多抗病毒转基因工程提供依据。第二个内容是用马铃薯Y病毒CP基因短片段构建反向重复转基因结构，这样转入植物后其转录产物可形成 dsRNA，探明是否这种结构的转基因策略能更多、更有效地获得高抗病毒的植株。研究的结果和结论主要如下：1， 用PVY-CP 5’端长202bp和3’端的长252 bp、202bp的短片段构建了植物表达载体，以pROKII为表达质粒，使这些没有起始密码子的非翻译的片段置于CaMV35S启动子下游，用烟草栽培品种NC89为转基因材料，通过农杆菌介导的转基因策略将基因转入并整合到烟草中，分别得到转基因烟草320、235、195株，烟草转基因植株的抗病测试表明，绝大多数的转基因植物表现感病，只有3株转5’端的202bp基因的植株表现抗病，表明转入非翻译马铃薯Y病毒CP基因的单片段短至202bp仍然可以产生抗病的转基因植株。2， 分子杂交的结果表明高抗转基因烟草的来源于转基因的RNA的表达水平明显低于表型症状为感病的转基因植株，这种转基因的抗病性与转基因植物中病毒 RNA发生特异性的降解相关联，表明这种抗病性是 RNA介导的。用来源于马铃薯Y病毒CP基因的3’端的短片段基因序列构建202bp的反向重复序列和正向重复序列的植物表达载体，不带起始密码的转基因均由CaMV35S<WP=8>3， 启动子驱动，共获得转正向重复片段的烟草植物220株，转反向重复片段的烟草植物198株，转基因植物的抗病性测试表明，反向重复序列的转基因烟草植物中82.8%的植株均表现为抗病，而所测试的正向重复片段的转基因植物没有一例是抗病表现。这种巨大的差异表明反向重复结构能更有效地诱导转录后基因沉默。4， 分子杂交结果表明，反向重复结构转基因抗病植物中来源于转基因的RNA表达水平明显低于转同样基因的感病植物和转正向重复结构的转基因植物，同样表明转基因植物的抗病性是由RNA介导的。5， 在以上研究的基础上，于反向重复结构的上游和两个重复片段之间插入马铃薯X病毒（PVX）的全长CP基因，构建了两个衍生的载体，通过农杆菌渗入试验使表达盒中的基因在烟草中瞬时表达，再接种PVX病毒，看是否由PVY CP基因反向重复结构导致的基因沉默可以延伸到重复区基因的上游和中间，初步测试结果表明，上游插入PVX CP基因的载体渗入的烟草有抗病性的表现。6， 为更深入的研究，以马铃薯X病毒的外壳蛋白基因全长和马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的3’端500bp长的基因片段为材料，以美国亚利桑那大学开发的用于转基因沉默的专用dsRNA植物表达载体pFGC5941构建了非翻译的反向重复结构、正向单片段结构、反向单片段结构的植物表达载体共六个，用农杆菌渗入的方法使其在烟草中瞬时表达并测其抗病性，初步的结果表明，反向重复结构的载体可以诱导植株上部叶片对病毒的抗性，通过Northern blot 杂交，表明用PVX CP反向重复结构载体渗入的植株中的病毒RNA表达水平低于感病植株和对照，符合RNA介导抗性的特征。