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肺癌是世界范围内最主要的致死原因,lncRNAs及micro RNAs被认为是一类肺癌的重要生物标记物,我们经过测序检测出肺癌组织中lncRNAs-ZFAS1表达明显升高。进一步经过RT-PCR测序发现lncRNAs-ZFAS1在肺癌组织中升高上调表达的同时,miR-150的表达明显降低,因此推测lncRNAs-ZFAS1可能抑制miR-150的表达。miR-150的靶基因被证实为ZEB1基因,本课题研究lncRNAs-ZFAS1与miR-150相互作用从而调节肺癌肿瘤细胞的发生发展机制。LncRNA ZFAS1在肺癌患者肿瘤组织中高表达经过RNA测序筛查发现lncRNAs在肺癌组织中出现明显的差异性表达,根据此结论lnc RNA ZFAS1作为研究切入点并进一步经过40例患者RT-PCR测序,RT-PCR测序结果与RNA测序筛查结果一致性较好,RT-PCR测序结果显示lnc RNA ZFAS1在肿瘤组织中的表达是癌旁组织的4倍,其数据具有明显的统计学差异(P值<0.05),另一方面miR-150的表达肺癌肿瘤组织是癌旁组织的60%,同样具有显著的统计学差异(P值<0.05),此检测结果提示lnc RNA ZFAS1可能在肺癌疾病发生过程中具有极其重要的作用。lnc RNA ZFAS1与miR-150呈现负相关调节,并据此推测出lnc RNA ZFAS1可能通过作用miR-150来调节肺癌肿瘤细胞的机制。miR-150靶向作用于ZEB1基因以及调节肺癌肿瘤细胞根据碱基互补法则并推测出miR-150的靶向作用目的基因为ZEB1,我们经过荧光素酶的检测实验得出miR-150与ZEB1基因相互作用的调控机制,其结果详见荧光素酶实验报告。在野生型3’UTR含有荧光素酶的ZEB1基因活性度被检测出明显降低。然而在突变型含有荧光素酶的ZEB1基因活性度被检测出没有明显差异。据此推测miR-150模拟物及正常升高的miR-150均可导致ZEB1基因的表达受到抑制,因此推测miR-150靶向抑制作用于ZEB1基因。另一方面,我们用miR-150模拟物及抑制物转染NCI-H460细胞。据此实验结果显示,当miR-150抑制物降低miR-150水平而模拟物明显诱导出miR-150水平的升高,同步经过western blotting蛋白印迹法检测ZEB1基因蛋白表达水平。其检测结果显示经过miR-150模拟物转染NCI-H460细胞其ZEB1蛋白表达水平为对照组的30%。然而miR-150抑制物转染的NCI-H460细胞,其ZEB1基因的蛋白表达水平是miR-150抑制物阴性对照组的3倍,细胞的增殖活性评估通过CCK-8法检测证实实验结论。miR-150模拟物阴性对照组及miR-150抑制物组间经过5天的培养没有明显差异。然而miR-150模拟物转染细胞的第二天检测到肺癌NCI-H460细胞增殖受到明显抑制。我们在细胞水平的检测证实miR-150与ZEB1基因的相互作用。因体内环境是一个更加复杂的调控网络系统。为了进一步探究miR-150与ZEB1基因的相互作用,我们在裸鼠肿瘤形成实验中同样得到验证。经过转染miR-150模拟物的NCI-H460细胞种植在裸鼠皮下,其肿瘤重量明显与对照组减轻,然而miR-150和ZEB1均过表达的细胞成瘤实验中与对照组比较其瘤体重量增加。实验中关注肿瘤的形态对比,miR-150过表达的实验组瘤体大小明显小于对照组,据此推测miR-150具有抑制肺癌细胞增殖和加快肿瘤细胞凋亡的作用。如同时过表达miR-150和ZEB1基因导致肿瘤体积大于对照组,因此推测ZEB1是一个与肿瘤形成成正相关的重要基因。因为肿瘤细胞的细胞增殖活性能被客观的检测出来,我们也能推测出肿瘤细胞的潜在的浸润和迁移等细胞生物学行为,因此我们用transwell分析技术及划痕实验技术来评估肺癌细胞的侵袭及转移迁移活性。其实验结果与我们前期预测相吻合。当miR-150在细胞内的表达被抑制后肺癌细胞NCI-H460的侵袭细胞数目明显增多及迁移活性加速,与此相反如果miR-150在细胞内的表达水平增加,其肺癌细胞NCI-H460的侵袭细胞数目减少及迁移活性减弱,根据上述的transwell和划痕实验结果分析得出miR-150被证实在肺癌的病理演进过程中是一个非常关键的细胞因子,miR-150起到了抑制细胞增殖及促进肺癌细胞凋亡的作用,同时也显示出miR-150具有抑制肺癌肿瘤细胞浸润和转移的潜能。相反的与阴性对照组比较,miR-150抑制物可以诱导出较高的细胞活力表达,因此提示miR-150抑制物转染的肺癌细胞具有比正常肺组织细胞更好的增殖能力。除了对NCI-H460细胞活力的检测外,我们同时对NCI-H460细胞的凋亡及细胞周期通过流式细胞仪进行了检测。通过转染miR-150模拟物在细胞内提高了miR-150表达水平,其凋亡细胞数目明显增加。同时处于S期的细胞数目明显下降,但大多数细胞停留在G1期和G2期。然而用miR-150抑制物转染NCI-H460细胞抑制了miR-150的表达得到了其相反的实验结果,即NCI-H460细胞凋亡数目明显减少和大多数培养细胞停留在S期,从该实验我们推测转染miR-150抑制物的细胞其增殖能力明显高于阴性对照组。肿瘤细胞的细胞增殖活性能被客观的检测出来,我们也能推测出细胞的潜在的浸润和迁移能力大小,因此我们用transwell分析技术及划痕实验技术来评估肺癌细胞的侵袭及转移迁移活性。其实验结果与我们前期预测相吻合。当miR-150在细胞内的表达被抑制以后肺癌细胞NCI-H460的侵袭细胞数目明显增多及迁移活性加速,于此相反如果miR-150在细胞内的表达水平增加,其肺癌细胞NCI-H460的侵袭细胞数目减少及迁移活性减弱,根据上述的transwell和划痕实验结果分析得出miR-150被证实在肺癌的发生进展过程中是一个非常重要的细胞因子,miR-150起到了抑制细胞增殖及促进肺癌细胞凋亡的作用,同时也显示出miR-150具有抑制肺癌肿瘤细胞的浸润和转移的潜能。miR-150作用于靶向基因ZEB1在调控肺癌细胞系中起到很重要作用自从证实miR-150靶向作用于ZEB1基因,我们试图进一步弄清在肺癌肿瘤细胞的各个演进阶段miR-150与ZEB1的相互关系。因此在NCI-H460系中miR-150和(或者)ZEB1的过表达进行的实验,我们在成功转染miR-150和(或者)ZEB1于NCI-H460系后其miR-150和ZEB1表达明显升高,如果只增加miR-150的过表达则会降低ZEB1的水平,与对照组相比较如同时过表达miR-150和ZEB1最终会升高ZEB1基因的表达水平,于此同时,运用CCK-8检测技术对每一个组进行细胞活性检测,得出实验结果为如增加miR-150表达水平则会抑制细胞活性,然而如果miR-150和ZEB1均过表达与对照组比较则会出现NCI-H460细胞活性明显增加,具此实验结果分析得出ZEB1基因在增加细胞增殖活性是一个重要的细胞因子,ZEB1基因也会被miR-150有效的调控。miR-150与ZEB1相互作用机制,在运用流式细胞仪进一步证实细胞凋亡及细胞周期的实验结果,并证实miR-150具有诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能,当miR-150表达水平升高与对照组相比其凋亡细胞数明显增加在S期的细胞变得更少,然而miR-150和ZEB1共转染则会诱导出miR-150和ZEB1均出现高表达,检测出凋亡细胞显著的减少及较多的转染细胞停留在S期,对NCI-H460肺癌细胞增殖起到了正向的积极作用。Transwell法和细胞划痕实验进一步证实了转染细胞的迁移和侵袭活性,与对照组比较miR-150过表达仅仅抑制细胞的转移及侵袭,然而过表达miR-150和ZEB1明显促进转染细胞的转移和浸润发生,并观察到侵袭细胞明显地增加和促进了转染细胞的转移进程加速,据此实验结果我们总结出miR-150特异靶向作用于ZEB1基因并抑制ZEB1基因的表达。miR-150调控肺癌细胞包括细胞增殖和细胞凋亡两个方面,从而肺癌细胞的转移和侵袭被miR-150负向调控。miR-150与ZEB1相互作用影响肿瘤的形成在细胞水平的检测,我们证实miR-150与ZEB1基因的相互作用。因体内环境是一个更加复杂的调控网络系统。为了进一步探究miR-150与ZEB1基因的相互作用,我们在裸鼠肿瘤形成实验中同样得到验证。经过转染miR-150模拟物的NCI-H460细胞种植在裸鼠皮下,其肿瘤重量明显增加,然而miR-150和ZEB1均过表达的细胞成瘤实验中与对照组比较其瘤体重量增加。实验中关注肿瘤的形态,miR-150过表达的实验组明显小于对照组,据此推测miR-150具有抑制肺癌细胞增殖和加快肿瘤细胞凋亡的作用。如同时过表达miR-150和ZEB1基因导致肿瘤体积大于对照组,因此推测ZEB1是一个与肿瘤形成成正相关的重要基因。