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背景新型冠状病毒（SARS-CoV-2）自2019年被首次报道以来在全球范围内引发了大规模流行,具有很强的传染性,可造成全身多种器官损伤。越来越多的研究证明了SARS-CoV-2对眼底各组织的感染能力。大量研究也报道了病毒感染者及康复者出现的眼底炎症及微血管病变。这些病例报道表明了SARS-CoV-2对眼底组织存在复杂的影响,但对于新型冠状病毒相关眼底病变的研究尚少,发生机制也尚不清楚。目前研究认为血-视网膜屏障的破坏是SARS-CoV-2介导眼底病变的关键,RPE细胞是血-视网膜外屏障的结构基础,RPE细胞的衰老与AMD等多种眼底慢性病变关系密切。不同因素刺激可诱发RPE细胞内ROS水平升高并通过P53/P21等机制引发细胞衰老,失去细胞原有功能。目前研究表明SARS-CoV-2可通过上调干扰素和Toll样受体诱导不同细胞的衰老过程,引发相应器官的慢性病理改变。眼部作为病毒的靶器官之一,在角膜、结膜、虹膜、RPE和视网膜毛细血管中均存在病毒受体表达,提示SARS-CoV-2可通过诱导眼部细胞衰老过程可引发眼部的慢性损伤,但具体机制研究尚少。本实验将研究新型冠状病毒刺突蛋白对人视网膜色素上皮衰老的影响,并对其发生机制进行探讨。目的本实验旨在研究SARS-CoV-2表面S蛋白对体外培养的人视网膜色素上皮细胞的影响,通过检测ROS、ER应激、NF-κB等通路探究S蛋白介导RPE细胞衰老的机制。为SARS-CoV-2介导的眼底慢性损伤机制研究提供思路,探讨新型冠状病毒S蛋白与视网膜慢性损伤之间的关系,为新型冠状病毒相关的后遗症防治提供理论依据。方法1.通过使用RTCA系统、流式细胞术、β-Gal染色、RT-qPCR等方法,利用重组S蛋白及S蛋白表达质粒（Flag-S质粒）,检测SARS-CoV-2 S蛋白对RPE细胞生长、细胞周期及衰老的影响。2.通过P21 siRNA转染,验证P21在重组S蛋白或S蛋白表达质粒诱导的RPE细胞衰老过程中的作用3.使用ROS抑制剂NAC处理RPE细胞,使用流式细胞术、β-Gal染色、免疫印迹等方法,检测ROS在重组S蛋白或S蛋白表达质粒诱导的RPE细胞衰老过程中的作用。4.使用NF-κB通路抑制剂BAY预处理细胞30min,使用免疫印迹、RT-qPCR等方法,检测NF-κB通路在重组S蛋白或S蛋白表达质粒诱导的RPE细胞衰老过程中的作用。5.使用免疫荧光检测S蛋白在细胞中的定位并用免疫印迹检测内质网应激相关蛋白,验证内质网应激在重组S蛋白或S蛋白表达质粒诱导的RPE细胞衰老过程中的作用。结果1.向RPE细胞中加入S蛋白或转染Flag-S质粒后,均出现了细胞生长水平降低（P＜0.05）、细胞周期G1期阻滞（P=0.0005,P=0.013）以及衰老细胞比例的增加（P=0.0001,P=0.0001）。RT-qPCR显示实验组细胞P53、P21、P14ARF、IL-1、IL-6、TGF-β、VEGFA、ICAM、BCL-XL的 mRNA表达水平升高,MMP-3 在S蛋白处理组表达量降低,MCP-1在过表达Flag-S蛋白组表达量降低（P＜0.01）。免疫印迹显示S蛋白处理后P53、P21、BCL-2及β-Gal蛋白表达增加,Elisa显示IL-1、IL-6在细胞上清中的含量增加（P＜0.05）。2.S蛋白处理或转染Flag-S质粒诱导衰老细胞比例增加（P＜0.0001,P=0.0005）,预先转染P21 siRNA后,加入S蛋白或转染Flag-S质粒所诱导的RPE衰老作用被消除,衰老细胞比例降低（P＜0.0001,P=0.0003）。3.S蛋白处理或转染Flag-S质粒的RPE细胞中ROS水平升高（P=0.0001,P=0.0001）,衰老细胞比例增加（P=0.0003,P=0.0001）。加入ROS抑制剂NAC后两组细胞衰老水平均降低（P=0.0003,P=0.0002）。S蛋白诱导P53、P21蛋白表达增加（P=0.0035,P=0.0359）,加入NAC共同处理后P53、P21蛋白表达降低（P=0.0067,P=0.0098）。4.加入S蛋白或转染Flag-S质粒后,免疫荧光显示S蛋白定位于内质网。S蛋白处理48h后,内质网应激相关蛋白ATF3、ATF6、CHOP表达水平升高,ATF4、Calnexin表达水平降低。加入NAC与S蛋白共同处理后,ATF6蛋白表达水平降低,ATF3、ATF4、Calnexin蛋白表达水平升高（P＜0.05）。5.免疫荧光显示,对照组P65聚集于胞质,加入S蛋白或转染Flag-S质粒后大部分P65由胞质转移至细胞核。核质分离结果显示,S蛋白处理后P65在细胞核内的含量增加。S蛋白处理后RPE细胞磷酸化iκB蛋白表达下降（P=0.0147）,加入NAC与S蛋白共同处理,磷酸化iκB蛋白表达增加（P=0.0383）。S蛋白诱导RPE细胞P53、P21蛋白表达升高（P=0.0351,P=0.0416）,使用BAY预处理30min后加入S蛋白,细胞P53蛋白表达水平降低（P=0.0104）,P21蛋白表达水平进一步升高（P=0.0202）。S蛋白诱导的RPE细胞衰老模型中mRNA含量增加的衰老相关因子P53、P21、P14ARF、TGF-β及ICAM在BAY预处理组中表达降低（P＜0.01）。结论新型冠状病毒S蛋白对人视网膜色素上皮的生长具有抑制作用,将细胞周期阻滞于G1期,通过内质网应激、ROS和NF-κB通路的激活介导RPE细胞衰老。