论文部分内容阅读
玉米赤霉烯酮(ZEA)是由镰刀菌等真菌产生的一种霉菌毒素,广泛存在于动物饲料和人类的食品中。研究表明,ZEA具有生殖发育毒性、遗传毒性、免疫毒性、致癌性。ZEA可以导致雄性动物的雄激素分泌下降,雄性动物雌性化和性欲降低,以及影响精子的生长发育,而睾丸支持细胞在生殖和精子发生过程中发挥着关键作用。但是到目前为止,人们对ZEA的雄性生殖毒性仍缺乏全面的认识,尤其是对ZEA的雄性生殖毒性的分子机理知之甚少。鉴于此,本研究通过建立ZEA与睾丸支持细胞体外模型,检测ZEA对支持细胞骨架结构和功能蛋白分泌的影响,从分子水平上探讨ZEA对睾丸支持细胞的毒性机理。本试验以原代睾丸支持细胞为对象,通过胰酶和胶原酶的消化分离支持细胞,利用台盼蓝,油红O以及FSHR免疫荧光对分离的细胞进行活率和纯度鉴定。本试验通过MTT法确定了ZEA的染毒浓度及染毒时间；通过激光共聚焦显微镜检测ZEA对支持细胞骨架蛋白α-tubulin, F-actin和细胞核的形态结构影响,利用透射电子显微镜观擦ZEA对支持细胞线粒体,内质网,高尔基体等超微结构的影响；利用QRT-PCR、 Wester-blot、 ELISA等实验技术检测ZEA对支持细胞ABP、Inhibin-β、FSHR、Vimentin、Transferrin和N-cadherin等功能蛋白分泌的影响。1.睾丸支持细胞的分离培养及鉴定。采用胰蛋白酶和胶原酶对睾丸组织进行二步消化,可以有效地分离到支持细胞,通过台盼蓝染法测定细胞获得的大鼠睾丸支持细胞活率在95%以上；利用油红O染色法和FSHR免疫荧光法对分离的睾丸支持细胞进行纯度鉴定,获得的大鼠睾丸支持细胞纯度在95%以上。2.ZEA对睾丸支持细胞骨架及超微结构的影响。MTT法确定本试验的ZEA染毒浓度为0 μg/mL、5 μg/mL、10μg/mL，20μg/mL,染毒时间为24h；激光共聚焦显微镜观察显示,随着ZEA染毒浓度的升高,支持细胞α-tubulin 和 F-actin等骨架蛋白和细胞核的损伤程度加大,染毒组细胞核呈新月状,形式凹陷,严重可见核碎裂；透视电镜观察显示,ZEA可以破坏支持细胞的内部结构,包括线粒体出现脊脱落甚至消失、内质网出现模糊、水肿和断裂、细胞质内的空泡及脂肪滴破损。3.ZEA对睾丸支持细胞功能蛋白分泌的影响。QRT-PCR检测结果显示,FSH IR的染毒组与对照组mRNA相比表达并没有明显的变化,而ABP、Vimentin、 N-cadherin的mRNA表达与对照组相比都有不同程度的下降,其中ABP在10、20 μg/mL下降显著(P<0.05), Vimentin 和 N-cadherin在20μg/mL染毒组下降显著(P<0.05),相反,Transferrin的 mRNA表达随着ZEA染毒浓度的增加,与对照组相比均有显著性差异(P<0.01；P<0.05)。Wester-blot结果显示,与对照组相比,染毒组的ABP、FSHR、Vimentin、Transferrin、 N-cadherin蛋白表达均呈现明显的下降趋势(P<0.01;P<0.05)。ELISA结果显示,与对照组相比,染毒组Inhibin-β和Transferrin的浓度都有有不同程度的下降,其中Inhibin-P在10和20μg/mL染毒组下降显著(P<0.05),而Transferrin在20μg/mL染毒组下降显著(P<0.05)。结论认为,ZEA的雄性动物生殖毒性可能与其对支持细胞骨架的破坏进而影响了血睾屏障有关。ZEA可以影响支持细胞ABP、FSHR、Transferrin、Inhibin-β等功能蛋白的分泌,这些功能性蛋白表达的异常将直接影响到精子发育的调节和营养的供给。