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【目的】
本实验选用3、6、10月龄的快速老化小鼠SAMP8作为实验对象,结合“针灸治未病”思想,观察针灸“肾俞”穴、“百会”穴、“神门”穴对小鼠行为学、海马齿状回Aβ1-42表达、海马Tau蛋白表达、海马齿状回神经元数目以及神经元新生障碍的影响,探索阿尔茨海默病病理下海马齿状回神经元新生障碍的特点,以期为阿尔茨海默病病理形成与发展的机制研究提供新的切入点,并为针灸作为有效治疗手段改善神经元新生障碍以防治AD提供新的实验依据。
【方法】
选用3、6、10月龄的SAMP8小鼠及同龄且遗传背景相同的SAMR1小鼠作为实验对象。随机将3月龄SAMP8小鼠分为3M针灸组、3M模型组,每组各6只;3M正常组为6只3月龄SAMR1小鼠。随机将6月龄SAMP8小鼠分为6M针灸组、6M模型组,每组各6只;6M正常组为6只6月龄SAMR1小鼠。随机将10月龄SAMP8小鼠分为10M针灸组、10M模型组,每组各6只;10M正常组为6只10月龄SAMR1小鼠。3M针灸组、6M针灸组、10M针灸组分别在“百会”穴、双侧“神门”穴进行针刺,双侧“肾俞”穴进行艾灸,15min/次,1次/d。6d为1个疗程共进行4个疗程,疗程间间隔1d。疗程结束后,采用Morris水迷宫实验、开场实验、新物体识别实验检测各组小鼠行为学变化;免疫组化法检测各组小鼠海马Aβ1-42表达、NeuN(成熟神经元标记蛋白)表达,免疫印迹法检测各组小鼠Tau蛋白表达;免疫荧光双标法检测各组小鼠海马齿状回PCNA(增殖细胞核抗原)/NeuN、PCNA/DCX(未成熟神经元标记蛋白)阳性细胞表达。
【结果】
1.各组小鼠行为学变化:(1)Morris水迷宫实验显示,在水迷宫实验中,3M针灸组平均逃避潜伏期短于3M模型组(P<0.01),跨越平台次数多于3M模型组(P<0.05)。6M针灸组平均逃避潜伏期短于6M模型组(P<0.01),跨越平台次数多于6M模型组(P<0.05)。10M针灸组平均逃避潜伏期短于10M模型组,跨越平台次数多于10M模型组,但差异均无统计学意义。(2)开场实验显示,3M针灸组在中央区活动时间均长于3M模型组(P<0.05)。6M针灸组在中央区活动时间均长于6M模型组(P<0.01)。10M针灸组在中央区活动时间均长于10M模型组(P>0.05)(3)新物体识别实验显示,3M针灸组新物体识别系数高于3M模型组(P<0.05)。6M针灸组新物体识别系数高于6M模型组(P<0.05)。10M针灸组新物体识别系数高于10M模型组(P>0.05)。
2.各组小鼠海马齿状回Aβ1-42、NeuN表达以及海马Tau蛋白表达
免疫组化检测结果显示:与3M正常组相比,3M模型组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)升高(P<0.05),而NeuN平均光密度值降低(P<0.05);3M针灸组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)低于3M模型组(P<0.05),而NeuN平均光密度值高于3M模型组(P<0.05)。与6M正常组相比,6M模型组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)升高(P<0.01),而NeuN平均光密度值降低(P<0.01);6M针灸组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)低于6M模型组(P<0.01)而NeuN平均光密度值高于6M模型组(P<0.05)。与10M正常组相比,10M模型组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)升高(P<0.05),而NeuN平均光密度值降低(P<0.05);10M针灸组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)低于10M模型组(P>0.05),而NeuN平均光密度值高于10M模型组(P>0.05),差异均无统计学意义。比较Aβ1-42平均光密度值(MOD)在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:3M正常组<6M正常组<10M正常组;3M模型组<6M模型组<10M模型组;3M针灸组<6M针灸组<10M针灸组。比较NeuN平均光密度值(MOD)在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:10M正常组<6M正常组<3M正常组;10M模型组<6M模型组<3M模型组;10M针灸组<6M针灸组<3M针灸组。
Westernblot实验结果显示,与3M正常组相比,3M模型组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量升高(P<0.01);3M针灸组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量相对表达量低于3M模型组(P<0.01)。与6M正常组相比,6M模型组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量升高(P<0.01);6M针灸组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量相对表达量低于6M模型组(P<0.05)。与10M正常组相比,10M模型组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量升高(P<0.01);10M针灸组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量相对表达量低于10M模型组(P<0.05)。比较Tau蛋白相对表达量在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:3M正常组<6M正常组<10M正常组;3M模型组<6M模型组<10M模型组;3M针灸组<6M针灸组<10M针灸组。
3.各组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN、PCNA/DCX阳性细胞表达情况
免疫荧光双标检测结果显示:与3M正常组相比,3M模型组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达降低(P<0.01),而PCNA/DCX阳性细胞表达增高(P<0.01);3M针灸组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达高于3M模型组(P<0.01),PCNA/DCX阳性细胞表达高于3M模型组(P<0.05)。与6M正常组相比,6M模型组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达降低(P<0.05),而PCNA/DCX阳性细胞表达增高(P<0.01);6M针灸组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达高于6M模型组(P<0.01),PCNA/DCX阳性细胞表达高于6M模型组(P<0.01)。与10M正常组相比,10M模型组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达降低(P<0.01),而10M模型组小鼠海马齿状回PCNA/DCX阳性细胞表达增高(P<0.05);10M针灸组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达高于10M模型组(P>0.05),PCNA/DCX阳性细胞表达高于10M模型组(P>0.05),差异无统计学均意义。比较PCNA/NeuN、PCNA/DCX阳性细胞表达在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:10M正常组<6M正常组<3M正常组;10M模型组<6M模型组<3M模型组;10M针灸组<6M针灸组<3M针灸组。
4.各组小鼠海马齿状回神经元新生功能比较
PCNA/NeuN阳性率记为A、PCNA/DCX阳性率记为B,C=B/(A+B),C值代表海马齿状回神经元新生功能。C3M正常组>C3M针灸组>C3M模型组;C6M正常组>C6M针灸组>C6M模型组;C10M正常组>C10M针灸组>C10M模型组。比较C值在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示C3M正常组>C6M正常组>C10M正常组;C3M模型组>C6M模型组>C10M模型组;C3M针灸组>C6M针灸组>C10M针灸组。
【结论】
伴随月龄增加,在行为学方面,SAMP8小鼠空间学习记忆能力和工作记忆能力逐渐下降,并出现焦虑抑郁等消极情绪;在病理学方面,SAMP8小鼠海马齿状回Aβ1-42表达增加、海马区Tau蛋白表达水平升高、海马齿状回NeuN表达减少,揭示了SAMP8小鼠关于AD的病理变化即Aβ沉积、神经元纤维缠结、神经元丢失均呈增龄性加重,SAMP8小鼠海马齿状回PCNA/NeuN、PCNA/DCX阳性细胞表达随着月龄增加而减少,进一步提示海马齿状回神经元新生数量减少,出现渐进性神经元新生障碍,揭示了AD病理下海马齿状回神经元新生障碍的特点即新生的神经元过少无以补偿损失的神经元。针灸治疗可上调SAMP8小鼠海马齿状回NeuN、DCX表达,使神经元新生数量增加,改善海马神经元新生障碍,延缓AD病理进程,提高SAMP8小鼠学习记忆能力。且根据统计学结果可以确定针灸对3月龄、6月龄SAMP8小鼠的治疗效果均优于10月龄SAMP8小鼠,可能提示针灸最佳干预点在6月龄之前。
本实验选用3、6、10月龄的快速老化小鼠SAMP8作为实验对象,结合“针灸治未病”思想,观察针灸“肾俞”穴、“百会”穴、“神门”穴对小鼠行为学、海马齿状回Aβ1-42表达、海马Tau蛋白表达、海马齿状回神经元数目以及神经元新生障碍的影响,探索阿尔茨海默病病理下海马齿状回神经元新生障碍的特点,以期为阿尔茨海默病病理形成与发展的机制研究提供新的切入点,并为针灸作为有效治疗手段改善神经元新生障碍以防治AD提供新的实验依据。
【方法】
选用3、6、10月龄的SAMP8小鼠及同龄且遗传背景相同的SAMR1小鼠作为实验对象。随机将3月龄SAMP8小鼠分为3M针灸组、3M模型组,每组各6只;3M正常组为6只3月龄SAMR1小鼠。随机将6月龄SAMP8小鼠分为6M针灸组、6M模型组,每组各6只;6M正常组为6只6月龄SAMR1小鼠。随机将10月龄SAMP8小鼠分为10M针灸组、10M模型组,每组各6只;10M正常组为6只10月龄SAMR1小鼠。3M针灸组、6M针灸组、10M针灸组分别在“百会”穴、双侧“神门”穴进行针刺,双侧“肾俞”穴进行艾灸,15min/次,1次/d。6d为1个疗程共进行4个疗程,疗程间间隔1d。疗程结束后,采用Morris水迷宫实验、开场实验、新物体识别实验检测各组小鼠行为学变化;免疫组化法检测各组小鼠海马Aβ1-42表达、NeuN(成熟神经元标记蛋白)表达,免疫印迹法检测各组小鼠Tau蛋白表达;免疫荧光双标法检测各组小鼠海马齿状回PCNA(增殖细胞核抗原)/NeuN、PCNA/DCX(未成熟神经元标记蛋白)阳性细胞表达。
【结果】
1.各组小鼠行为学变化:(1)Morris水迷宫实验显示,在水迷宫实验中,3M针灸组平均逃避潜伏期短于3M模型组(P<0.01),跨越平台次数多于3M模型组(P<0.05)。6M针灸组平均逃避潜伏期短于6M模型组(P<0.01),跨越平台次数多于6M模型组(P<0.05)。10M针灸组平均逃避潜伏期短于10M模型组,跨越平台次数多于10M模型组,但差异均无统计学意义。(2)开场实验显示,3M针灸组在中央区活动时间均长于3M模型组(P<0.05)。6M针灸组在中央区活动时间均长于6M模型组(P<0.01)。10M针灸组在中央区活动时间均长于10M模型组(P>0.05)(3)新物体识别实验显示,3M针灸组新物体识别系数高于3M模型组(P<0.05)。6M针灸组新物体识别系数高于6M模型组(P<0.05)。10M针灸组新物体识别系数高于10M模型组(P>0.05)。
2.各组小鼠海马齿状回Aβ1-42、NeuN表达以及海马Tau蛋白表达
免疫组化检测结果显示:与3M正常组相比,3M模型组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)升高(P<0.05),而NeuN平均光密度值降低(P<0.05);3M针灸组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)低于3M模型组(P<0.05),而NeuN平均光密度值高于3M模型组(P<0.05)。与6M正常组相比,6M模型组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)升高(P<0.01),而NeuN平均光密度值降低(P<0.01);6M针灸组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)低于6M模型组(P<0.01)而NeuN平均光密度值高于6M模型组(P<0.05)。与10M正常组相比,10M模型组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)升高(P<0.05),而NeuN平均光密度值降低(P<0.05);10M针灸组小鼠海马齿状回Aβ1-42平均光密度值(MOD)低于10M模型组(P>0.05),而NeuN平均光密度值高于10M模型组(P>0.05),差异均无统计学意义。比较Aβ1-42平均光密度值(MOD)在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:3M正常组<6M正常组<10M正常组;3M模型组<6M模型组<10M模型组;3M针灸组<6M针灸组<10M针灸组。比较NeuN平均光密度值(MOD)在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:10M正常组<6M正常组<3M正常组;10M模型组<6M模型组<3M模型组;10M针灸组<6M针灸组<3M针灸组。
Westernblot实验结果显示,与3M正常组相比,3M模型组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量升高(P<0.01);3M针灸组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量相对表达量低于3M模型组(P<0.01)。与6M正常组相比,6M模型组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量升高(P<0.01);6M针灸组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量相对表达量低于6M模型组(P<0.05)。与10M正常组相比,10M模型组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量升高(P<0.01);10M针灸组小鼠海马区Tau蛋白相对表达量相对表达量低于10M模型组(P<0.05)。比较Tau蛋白相对表达量在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:3M正常组<6M正常组<10M正常组;3M模型组<6M模型组<10M模型组;3M针灸组<6M针灸组<10M针灸组。
3.各组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN、PCNA/DCX阳性细胞表达情况
免疫荧光双标检测结果显示:与3M正常组相比,3M模型组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达降低(P<0.01),而PCNA/DCX阳性细胞表达增高(P<0.01);3M针灸组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达高于3M模型组(P<0.01),PCNA/DCX阳性细胞表达高于3M模型组(P<0.05)。与6M正常组相比,6M模型组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达降低(P<0.05),而PCNA/DCX阳性细胞表达增高(P<0.01);6M针灸组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达高于6M模型组(P<0.01),PCNA/DCX阳性细胞表达高于6M模型组(P<0.01)。与10M正常组相比,10M模型组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达降低(P<0.01),而10M模型组小鼠海马齿状回PCNA/DCX阳性细胞表达增高(P<0.05);10M针灸组小鼠海马齿状回PCNA/NeuN阳性细胞表达高于10M模型组(P>0.05),PCNA/DCX阳性细胞表达高于10M模型组(P>0.05),差异无统计学均意义。比较PCNA/NeuN、PCNA/DCX阳性细胞表达在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示:10M正常组<6M正常组<3M正常组;10M模型组<6M模型组<3M模型组;10M针灸组<6M针灸组<3M针灸组。
4.各组小鼠海马齿状回神经元新生功能比较
PCNA/NeuN阳性率记为A、PCNA/DCX阳性率记为B,C=B/(A+B),C值代表海马齿状回神经元新生功能。C3M正常组>C3M针灸组>C3M模型组;C6M正常组>C6M针灸组>C6M模型组;C10M正常组>C10M针灸组>C10M模型组。比较C值在各月龄小鼠中的增龄性变化,结果显示C3M正常组>C6M正常组>C10M正常组;C3M模型组>C6M模型组>C10M模型组;C3M针灸组>C6M针灸组>C10M针灸组。
【结论】
伴随月龄增加,在行为学方面,SAMP8小鼠空间学习记忆能力和工作记忆能力逐渐下降,并出现焦虑抑郁等消极情绪;在病理学方面,SAMP8小鼠海马齿状回Aβ1-42表达增加、海马区Tau蛋白表达水平升高、海马齿状回NeuN表达减少,揭示了SAMP8小鼠关于AD的病理变化即Aβ沉积、神经元纤维缠结、神经元丢失均呈增龄性加重,SAMP8小鼠海马齿状回PCNA/NeuN、PCNA/DCX阳性细胞表达随着月龄增加而减少,进一步提示海马齿状回神经元新生数量减少,出现渐进性神经元新生障碍,揭示了AD病理下海马齿状回神经元新生障碍的特点即新生的神经元过少无以补偿损失的神经元。针灸治疗可上调SAMP8小鼠海马齿状回NeuN、DCX表达,使神经元新生数量增加,改善海马神经元新生障碍,延缓AD病理进程,提高SAMP8小鼠学习记忆能力。且根据统计学结果可以确定针灸对3月龄、6月龄SAMP8小鼠的治疗效果均优于10月龄SAMP8小鼠,可能提示针灸最佳干预点在6月龄之前。