论文部分内容阅读
血栓栓塞性疾病是一种严重危害人类健康的常见疾病,包括静脉血栓栓塞性疾病(深静脉血栓形成、肺栓塞)和动脉血栓栓塞性疾病(心肌缺血、缺血性脑梗塞)。血栓形成及其并发症已成为世界范围内致残率和致死率最高的疾病之一。血栓栓塞性疾病是一种多因素性疾病,遗传性易栓背景及获得性易栓因素均在其发病中发挥着不可或缺的作用。尽管目前已有很多基因变异导致的凝血或抗凝蛋白功能失调被认为与血栓形成具有关联,但仍有许多血栓患者的遗传背景不能被目前已知的遗传性易栓背景所解释,故而探索新的可能与血栓形成相关的基因变异显得尤为重要。近来有研究表明,β2GPI是体内一种天然的抗凝蛋白,主要通过抑制凝血酶的凝血活性但不影响凝血酶对蛋白C的激活而发挥抗凝作用。目的：β2GPI编码基因为APOH,本研究以APOH基因作为候选基因,研究其多态性是否与为中国人群血栓栓塞性疾病的危险因素；并进一步探索APOH基因多态性导致β2GPI下降及血栓形成的具体机制。方法：选择26例狼疮抗凝物质阳性的患者,通过对其APOH基因的8个外显子及其剪接位点、3端及5端非翻译区进行PCR后直接测序的方法查找基因变异；随机挑选60例静脉血栓患者,缺血性脑梗塞患者及正常对照组DNA进行测序验证第一步所发现的基因变异,并大致评估其对疾病形成的风险；用Haploview4.0软件行基因变异的连锁不平衡分析；进一步扩大样本量行病例对照研究(1304例VTE vs1334例正常组；1444例IS vs1334例正常组)评估基因变异对血栓形成的风险比；挑选各类型血浆行Mestern blot及ELISA行β2GPI抗原水平检测及凝血功能试验(凝血酶原时间及凝血酶生成实验)；体外重组野生型及突变型APOH表达质粒行细胞实验,检测基因变异对p2GPI的表达及凝血功能的影响。结果：在26例狼疮抗凝物阳性的患者中主要发现了四个基因多态性,c.1004G>C、 c.461G>A.c4221>C、c.-32C>A,结果显示这4种APOH基因多态性完全连锁不平衡(D’=1,r2=1),选用c.461G>A作为限制性内切酶酶切代表,形成三种单倍型H1(CTGG/CTGG),H2(CTGG/ACAC)及H3(ACAC/ACAC).酶切结果显示H2,H3单倍型对静脉血栓形成的优势比为1.5和7,而其对动脉血栓形成作用不大。血浆实验发现,H2,H3单倍型血浆β2GPI蛋白减少,凝血酶原时间缩短,凝血酶生成增多。细胞实验证实c.-32C>A造成APOH基因的表达水平下降,导致细胞内外β2GPI蛋白均减少。含p.Trp335Ser、p.Arg154His、p.Ile141Thr的突变蛋白使血浆凝血酶原时间缩短,凝血酶生成能力增强;当血浆β2GPI蛋白浓度降低时也呈现出相同的作用。结论：APOH基因突变造成的β2GPI蛋白质和量的下降均有利于血栓形成,可将其作为血栓性疾病的候选基因,可用于由常规凝血及抗凝蛋白遗传背景不能解释的血栓患者的遗传背景分析。