aurJ3M、aurT基因对金褐霉素生物合成的调控作用研究

来源 :辽宁大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:qingcongll
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金褐霉素(Aureofuscin)是由金褐链霉菌(Streptomyces aureofuscus)产生的一种次级代谢产物,属于四烯大环内酯类抗生素,具有抗真菌活性,有待应用在医疗卫生、食品加工等更广泛的领域。因其生物合成的调控机制尚未明确,金褐霉素的产量较低,限制其进一步应用,所以提高金褐霉素的产量成为重中之重。前期实验通过在金褐链霉菌中过表达aurJ3M基因,高效液相色谱(HPLC)分析检测发酵产物,金褐霉素产量提高5-6倍。本论文针对aurJ3M和aurT的功能和调控作用进行近一步研究。(1)生物信息学分析表明,在金褐链霉菌中存在属于PAS-LuxR家族的调控因子AurJ3M(EU697915.1),构建aurJ3M基因敲除质粒pC1203-11599,通过发酵产物形态观察,HPLC测定aurJ3M基因敲除突变株(ΔaurJ3M)不能合成金褐霉素,初步证实aurJ3M基因对金褐霉素的生物合成起正向调控作用;进一步通过反转录PCR实验分析,与野生型菌株相比,在ΔaurJ3M中聚酮合成酶基因S0、S1和基因B、C、G、F、D均不发生转录,I、J、A基因转录水平显著降低,R、E、H基因的表达不受影响,S0和S1基因的不表达都会抑制金褐霉素产生。结果显示aurJ3M是金褐霉素生物合成的途径特异性调节因子,通过调节基因簇中结构基因的转录表达来影响金褐霉素的合成。(2)通过分子克隆,获得了新基因aurT(Genbank登录号:MH247109.1),生物信息学分析AurT蛋白结构表明AurT属于RhtB家族调控因子,是金褐链霉菌的氨基酸转运蛋白,aurT基因过表达菌株(♂aurT)中金褐霉素产量提高了1.3倍,aurT基因敲除菌株(ΔaurT)金褐霉素产量损失了65%,但仍有金褐霉素产生,并没有完全抑制其生产,这与途径特异性调控因子AurJ3M的调控方式不同。(3)以野生型菌株S.aureofuscus SYAU0709为对照,筛选添加四种不同PI因子结构类似物(1,2-丙二醇、丙三醇、乙二醇、三乙醇胺),结果显示外源添加质量浓度为0.4mL的丙三醇,发酵时间达96h时,对调控金褐霉素的合成效果最佳;另外与野生型菌株S.aureofuscus SYAU0709的金褐霉素产量(693μg·mL-1)相比,外源添加丙三醇后产量提高了1.5倍(1034μg·mL-1),ΔaurT菌株金褐霉素产量243μg·mL-1,外源添加丙三醇后产量提高到784μg·mL-1,与野生型菌株S.aureofuscus SYAU0709的产量接近,检测发酵产物发现又恢复了金褐霉素野生型菌株的产量。表明质量浓度为0.4mL的PI-因子结构类似物与基因簇内特异性受体结合,启动相关基因的表达,参与金褐霉素的生物合成调控。
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