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背景及目的：
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近年来肺癌的诊断和治疗已取得很大进步，但大部分患者尤其是晚期患者的五年生存率仍很低。尽管2013年癌症免疫治疗元年的到来改写了NSCLC(非小细胞肺癌)的治疗模式，晚期NSCLC患者5年生存率也仅仅提升至16%。化疗等传统治疗常存在难以耐受的不良反应和耐药等问题，还可诱导肿瘤细胞表面PD-L1表达升高等，从而引发免疫抑制而导致疾病进展。免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1单抗单药治疗在NSCLC中的有效率也仅为20%左右。因此，免疫检查点抑制剂与化疗等治疗的联合是未来肿瘤治疗的发展方向。但免疫检查点抑制剂与化疗、靶向治疗等在肺癌中的联合使用也存在争议，例如EGFR-TKI与PD-1/PD-L1单抗联合将促进EGFR敏感突变肺癌的进展。因此，寻找肺癌治疗新靶点及其与免疫治疗联合策略是目前亟待解决的问题。
CENP-E(着丝粒蛋白E)是一种着丝粒相关蛋白，主要参与细胞周期调控。CENP-E在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，目前研究提示CENP-E可能是NSCLC驱动基因候选基因，但其在肺癌中的作用以及联合PD-L1单抗治疗是否可提高抗肿瘤反应尚无报道。
本课题的目的是明确CENP-E在肺癌中的表达及与预后的关系、抑制CENP-E在肺癌中的直接抗肿瘤作用、抑制CENP-E后是否可影响肺癌细胞PD-L1的表达及免疫微环境，以及抑制CENP-E与PD-L1单抗联合在肺癌中的疗效。这些问题的解决将为CENP-E作为肺癌治疗的新靶点，及与PD-L1单抗等免疫治疗的联合使用提供理论依据。
材料与方法：
1.通过生物信息学分析网站，分析CENP-E在肺癌中的表达水平及其与肺癌患者预后的相关性，并通过Westernblot及免疫组化分别在人肺癌细胞系及肺癌组织中进行验证；同时初步探讨肺癌中CENP-E表达与免疫相关分子表达的关系；
2.通过CCK-8实验和EdU实验明确CENP-E特异性抑制剂GSK923295抑制CENP-E后对肺癌细胞生长增殖的影响；通过克隆形成实验探讨GSK923295抑制CENP-E后对肺癌细胞克隆形成能力的影响；采用PI周期染色检测GSK923295抑制CENP-E后肺癌细胞的周期分布情况；最后通过A549肺癌裸鼠模型验证GSK923295的抗肿瘤作用，通过Lewis肺癌C57小鼠模型验证敲低CENP-E的抗肿瘤作用；
3.通过RNA测序分析经GSK923295(100nmol/L)处理72小时后A549的mRNA变化，初步探讨CENP-E抑制后肺癌细胞中PD-L1等免疫相关分子表达的变化；随后通过RT-PCR、Westernblot和流式检测技术验证GSK923295处理肺癌细胞后PD-L1表达的变化；最后通过mRNA稳定性实验、3’UTR荧光素酶报告基因实验及RIP实验明确CENP-E对PD-L1的mRNA稳定性的调控机制；
4.将经GSK923295处理72h后的A549与肺癌患者恶性胸腔积液中的单个核细胞共培养，使用流式检测技术检测其中CD4+T细胞、CD8+T细胞、凋亡T细胞、NK细胞、Tregs细胞的比例，及T细胞表面PD-1和PD-L1的表达情况；最后通过Lewis肺癌小鼠模型验证CENP-E对肺癌免疫微环境的影响；
5.体外实验中采用A549与肺癌患者恶性胸腔积液来源的单个核细胞共培养进行克隆形成实验，观察GSK923295联合PD-L1单抗对A549克隆形成能力的影响；体内动物实验中，构建CENP-E稳定敲低的Lewis肺癌细胞系，联合PD-L1单抗治疗，观察肿瘤的生长情况和免疫微环境的变化。
结果:
1.生物信息学数据表明，CENP-E在肺癌中的表达明显升高，肺腺癌和肺鳞癌肿瘤组织较癌旁组织依次升高5.8及13.5倍(p<0.001)，且CENP-E高表达提示肺癌患者预后不佳，CENP-E低表达Vs.高表达组中位OS依次为96Vs.45个月(p<0.001)；此外，CENP-E与免疫检查点PD-L1(CD274)、Galectin-9和HVEM呈负相关(R值依次为－0.482、－0.312、－0.590，均p<0.001)，与T细胞活化因子IL2、IL12B呈正相关而与免疫抑制因子TGFB1呈负相关(R值依次为0.368、0.368、－0.524，均p<0.001)；
2.CENP-E特异性抑制剂GSK923295处理肺癌细胞系A549及H522，可抑制其生长增殖。尤其是在100nmol/L的浓度下，A549的增殖细胞比值明显降低(0.293±0.031Vs.0.008±0.002，p<0.001)，A549的克隆形成数目也明显减少(223.0±9.5Vs.60.7±2.4，p<0.001)，同时导致细胞周期阻滞于G2/M期(p<0.001)；GSK923295在免疫缺陷的A549肺癌裸鼠模型中也使肿瘤的体积(1359.0±266.7mm3Vs.139.2±70.3mm3，p<0.001)和重量明显退缩，可明显抑制肿瘤生长；而在免疫健全的C57/BL6小鼠中，敲低CENP-E后荷瘤小鼠的肿瘤体积下降趋势(p=0.011)明显不如CENP-E抑制剂在裸鼠模型中的作用，由此推测抑制CENP-E在抗肿瘤的同时可能在体内导致一定程度的免疫反应损害；
3.RNA测序结果提示CENP-E抑制后PD-L1、IL-33等免疫抑制分子上调，且IFNGR、IL-6、JAK3等参与PD-L1调节的因子表达亦上调；进一步验证发现GSK923295可在mRNA和蛋白质水平升高肺癌细胞中PD-L1表达，且这种效应呈时间依赖性和浓度依赖性，100nmol/L的GSK923295处理72小时后，A549细胞PD-L1蛋白表达明显上调(1.000±0.062Vs.2.125±0.109，p<0.001)；进一步的机制研究证实GSK923295抑制CENP-E后可通过减弱TTP对PD-L1-3’UTR的作用，从而增强PD-L1的mRNA稳定性和表达；
4.经GSK923295(100nmol/L)处理72小时后的A549与肺癌患者恶性胸腔积液中单个核细胞共培养，可使CD8+T细胞/CD4+T细胞比值降低(1.76±0.18Vs.1.10±0.08，p=0.004)、凋亡CD4+T细胞和凋亡CD8+T细胞的比例增多(p=0.029，p=0.012)，CD4+T细胞表面PD-L1和PD-1的平均荧光强度MFI均升高(p=0.006，p<0.001)、CD8+T细胞表面PD-L1和PD-1的平均荧光强度MFI也升高(均p<0.001)，而NK细胞比例降低(p=0.001)、且Tregs比例由对照组中(13.07±0.12)%增多至(21.30±1.39)%(p=0.009)；在Lewis肺癌小鼠模型中敲低CENP-E将减少肺癌组织中CD8+T细胞及IFN-γ+CD8+T细胞［Ctrl-shRNA组Vs.CENPE-shRNA#3组：(18.82±6.26)%Vs.(11.78±2.07)%，p=0.044］的浸润，伴Tregs细胞增多［Ctrl-shRNA组Vs.CENPE-shRNA#3组：(11.12±0.67)%Vs.(14.06±1.16)%，p=0.001］；
5.体外实验提示GSK923295与PD-L1单抗联合使用可降低A549细胞克隆形成能力(1:25共培养时克隆数：GSK923295单药组Vs.联合组：116.00±29.34Vs.8.00±5.00，p=0.003)；体内动物实验提示在CENP-E稳定敲低的Lewis肺癌小鼠模型中联合使用PD-L1单抗可进一步促进肿瘤体积和重量的退缩(第30天时肿瘤体积：IgG+CENPE-shRNA#1组Vs.PD-L1单抗+CENPE-shRNA#1组：1388.46±159.90mm3Vs.572.82±210.73mm3,p<0.01；IgG+CENPE-shRNA#3组Vs.PD-L1单抗+CENPE-shRNA#3组：1213.69±108.46mm3Vs.504.89±113.80mm3,p<0.01)；此外，联合使用PD-L1单抗将减弱CENP-E敲低所导致的免疫抑制，使肿瘤浸润CD107+CD8+T细胞比例由(1.65±0.31)%恢复至(13.15±2.34)%(p<0.001)并减少Tregs浸润［(IgG+CENPE-shRNA#3组Vs.PD-L1单抗+CENPE-shRNA#3组：(23.40±2.06)%Vs.(7.38±1.80)%］(p<0.001)，恢复小鼠体内的抗肿瘤免疫功能。
结论：首先，本研究明确了CENP-E在肺癌中高表达且与肺癌患者预后呈负相关。其次，抑制CENP-E虽可直接抑制肿瘤生长，但可通过TTP靶向3’UTR而提高PD-L1的mRNA稳定性和表达，导致免疫抑制，削弱了CENP-E抑制剂的体内抗肿瘤效果。最后，抑制CENP-E与PD-L1单抗的联合使用，可明显减弱CENP-E抑制所导致的免疫反应损害，从而增强在肺癌中的抗肿瘤效果。我们的研究为CENP-E作为肺癌的治疗靶点以及与PD-L1单抗联合使用提供了理论依据。
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。近年来肺癌的诊断和治疗已取得很大进步，但大部分患者尤其是晚期患者的五年生存率仍很低。尽管2013年癌症免疫治疗元年的到来改写了NSCLC(非小细胞肺癌)的治疗模式，晚期NSCLC患者5年生存率也仅仅提升至16%。化疗等传统治疗常存在难以耐受的不良反应和耐药等问题，还可诱导肿瘤细胞表面PD-L1表达升高等，从而引发免疫抑制而导致疾病进展。免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1单抗单药治疗在NSCLC中的有效率也仅为20%左右。因此，免疫检查点抑制剂与化疗等治疗的联合是未来肿瘤治疗的发展方向。但免疫检查点抑制剂与化疗、靶向治疗等在肺癌中的联合使用也存在争议，例如EGFR-TKI与PD-1/PD-L1单抗联合将促进EGFR敏感突变肺癌的进展。因此，寻找肺癌治疗新靶点及其与免疫治疗联合策略是目前亟待解决的问题。
CENP-E(着丝粒蛋白E)是一种着丝粒相关蛋白，主要参与细胞周期调控。CENP-E在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，目前研究提示CENP-E可能是NSCLC驱动基因候选基因，但其在肺癌中的作用以及联合PD-L1单抗治疗是否可提高抗肿瘤反应尚无报道。
本课题的目的是明确CENP-E在肺癌中的表达及与预后的关系、抑制CENP-E在肺癌中的直接抗肿瘤作用、抑制CENP-E后是否可影响肺癌细胞PD-L1的表达及免疫微环境，以及抑制CENP-E与PD-L1单抗联合在肺癌中的疗效。这些问题的解决将为CENP-E作为肺癌治疗的新靶点，及与PD-L1单抗等免疫治疗的联合使用提供理论依据。
材料与方法：
1.通过生物信息学分析网站，分析CENP-E在肺癌中的表达水平及其与肺癌患者预后的相关性，并通过Westernblot及免疫组化分别在人肺癌细胞系及肺癌组织中进行验证；同时初步探讨肺癌中CENP-E表达与免疫相关分子表达的关系；
2.通过CCK-8实验和EdU实验明确CENP-E特异性抑制剂GSK923295抑制CENP-E后对肺癌细胞生长增殖的影响；通过克隆形成实验探讨GSK923295抑制CENP-E后对肺癌细胞克隆形成能力的影响；采用PI周期染色检测GSK923295抑制CENP-E后肺癌细胞的周期分布情况；最后通过A549肺癌裸鼠模型验证GSK923295的抗肿瘤作用，通过Lewis肺癌C57小鼠模型验证敲低CENP-E的抗肿瘤作用；
3.通过RNA测序分析经GSK923295(100nmol/L)处理72小时后A549的mRNA变化，初步探讨CENP-E抑制后肺癌细胞中PD-L1等免疫相关分子表达的变化；随后通过RT-PCR、Westernblot和流式检测技术验证GSK923295处理肺癌细胞后PD-L1表达的变化；最后通过mRNA稳定性实验、3’UTR荧光素酶报告基因实验及RIP实验明确CENP-E对PD-L1的mRNA稳定性的调控机制；
4.将经GSK923295处理72h后的A549与肺癌患者恶性胸腔积液中的单个核细胞共培养，使用流式检测技术检测其中CD4+T细胞、CD8+T细胞、凋亡T细胞、NK细胞、Tregs细胞的比例，及T细胞表面PD-1和PD-L1的表达情况；最后通过Lewis肺癌小鼠模型验证CENP-E对肺癌免疫微环境的影响；
5.体外实验中采用A549与肺癌患者恶性胸腔积液来源的单个核细胞共培养进行克隆形成实验，观察GSK923295联合PD-L1单抗对A549克隆形成能力的影响；体内动物实验中，构建CENP-E稳定敲低的Lewis肺癌细胞系，联合PD-L1单抗治疗，观察肿瘤的生长情况和免疫微环境的变化。
结果:
1.生物信息学数据表明，CENP-E在肺癌中的表达明显升高，肺腺癌和肺鳞癌肿瘤组织较癌旁组织依次升高5.8及13.5倍(p<0.001)，且CENP-E高表达提示肺癌患者预后不佳，CENP-E低表达Vs.高表达组中位OS依次为96Vs.45个月(p<0.001)；此外，CENP-E与免疫检查点PD-L1(CD274)、Galectin-9和HVEM呈负相关(R值依次为－0.482、－0.312、－0.590，均p<0.001)，与T细胞活化因子IL2、IL12B呈正相关而与免疫抑制因子TGFB1呈负相关(R值依次为0.368、0.368、－0.524，均p<0.001)；
2.CENP-E特异性抑制剂GSK923295处理肺癌细胞系A549及H522，可抑制其生长增殖。尤其是在100nmol/L的浓度下，A549的增殖细胞比值明显降低(0.293±0.031Vs.0.008±0.002，p<0.001)，A549的克隆形成数目也明显减少(223.0±9.5Vs.60.7±2.4，p<0.001)，同时导致细胞周期阻滞于G2/M期(p<0.001)；GSK923295在免疫缺陷的A549肺癌裸鼠模型中也使肿瘤的体积(1359.0±266.7mm3Vs.139.2±70.3mm3，p<0.001)和重量明显退缩，可明显抑制肿瘤生长；而在免疫健全的C57/BL6小鼠中，敲低CENP-E后荷瘤小鼠的肿瘤体积下降趋势(p=0.011)明显不如CENP-E抑制剂在裸鼠模型中的作用，由此推测抑制CENP-E在抗肿瘤的同时可能在体内导致一定程度的免疫反应损害；
3.RNA测序结果提示CENP-E抑制后PD-L1、IL-33等免疫抑制分子上调，且IFNGR、IL-6、JAK3等参与PD-L1调节的因子表达亦上调；进一步验证发现GSK923295可在mRNA和蛋白质水平升高肺癌细胞中PD-L1表达，且这种效应呈时间依赖性和浓度依赖性，100nmol/L的GSK923295处理72小时后，A549细胞PD-L1蛋白表达明显上调(1.000±0.062Vs.2.125±0.109，p<0.001)；进一步的机制研究证实GSK923295抑制CENP-E后可通过减弱TTP对PD-L1-3’UTR的作用，从而增强PD-L1的mRNA稳定性和表达；
4.经GSK923295(100nmol/L)处理72小时后的A549与肺癌患者恶性胸腔积液中单个核细胞共培养，可使CD8+T细胞/CD4+T细胞比值降低(1.76±0.18Vs.1.10±0.08，p=0.004)、凋亡CD4+T细胞和凋亡CD8+T细胞的比例增多(p=0.029，p=0.012)，CD4+T细胞表面PD-L1和PD-1的平均荧光强度MFI均升高(p=0.006，p<0.001)、CD8+T细胞表面PD-L1和PD-1的平均荧光强度MFI也升高(均p<0.001)，而NK细胞比例降低(p=0.001)、且Tregs比例由对照组中(13.07±0.12)%增多至(21.30±1.39)%(p=0.009)；在Lewis肺癌小鼠模型中敲低CENP-E将减少肺癌组织中CD8+T细胞及IFN-γ+CD8+T细胞［Ctrl-shRNA组Vs.CENPE-shRNA#3组：(18.82±6.26)%Vs.(11.78±2.07)%，p=0.044］的浸润，伴Tregs细胞增多［Ctrl-shRNA组Vs.CENPE-shRNA#3组：(11.12±0.67)%Vs.(14.06±1.16)%，p=0.001］；
5.体外实验提示GSK923295与PD-L1单抗联合使用可降低A549细胞克隆形成能力(1:25共培养时克隆数：GSK923295单药组Vs.联合组：116.00±29.34Vs.8.00±5.00，p=0.003)；体内动物实验提示在CENP-E稳定敲低的Lewis肺癌小鼠模型中联合使用PD-L1单抗可进一步促进肿瘤体积和重量的退缩(第30天时肿瘤体积：IgG+CENPE-shRNA#1组Vs.PD-L1单抗+CENPE-shRNA#1组：1388.46±159.90mm3Vs.572.82±210.73mm3,p<0.01；IgG+CENPE-shRNA#3组Vs.PD-L1单抗+CENPE-shRNA#3组：1213.69±108.46mm3Vs.504.89±113.80mm3,p<0.01)；此外，联合使用PD-L1单抗将减弱CENP-E敲低所导致的免疫抑制，使肿瘤浸润CD107+CD8+T细胞比例由(1.65±0.31)%恢复至(13.15±2.34)%(p<0.001)并减少Tregs浸润［(IgG+CENPE-shRNA#3组Vs.PD-L1单抗+CENPE-shRNA#3组：(23.40±2.06)%Vs.(7.38±1.80)%］(p<0.001)，恢复小鼠体内的抗肿瘤免疫功能。
结论：首先，本研究明确了CENP-E在肺癌中高表达且与肺癌患者预后呈负相关。其次，抑制CENP-E虽可直接抑制肿瘤生长，但可通过TTP靶向3’UTR而提高PD-L1的mRNA稳定性和表达，导致免疫抑制，削弱了CENP-E抑制剂的体内抗肿瘤效果。最后，抑制CENP-E与PD-L1单抗的联合使用，可明显减弱CENP-E抑制所导致的免疫反应损害，从而增强在肺癌中的抗肿瘤效果。我们的研究为CENP-E作为肺癌的治疗靶点以及与PD-L1单抗联合使用提供了理论依据。