【摘 要】
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1:人MUC16基因启动子区域的初步分析目的分析人MUC16基因的转录起始位点和重要的调控区域,确定人MUC16基因的核心启动子。方法用生物信息学分析人MUC16基因启动子所在区域。培养SKOV3细胞株并提取细胞基因组DNA,用PCR技术扩增启动子区域的594bp（-1844-1250/）、548bp（-1798/-1250）、326bp（-1576/-1250）和170bp（-1420/-125
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1:人MUC16基因启动子区域的初步分析目的分析人MUC16基因的转录起始位点和重要的调控区域,确定人MUC16基因的核心启动子。方法用生物信息学分析人MUC16基因启动子所在区域。培养SKOV3细胞株并提取细胞基因组DNA,用PCR技术扩增启动子区域的594bp（-1844-1250/）、548bp（-1798/-1250）、326bp（-1576/-1250）和170bp（-1420/-1250）的启动子片段,分别构建重组PGEM-T质粒,再克隆入荧光素酶报告基因载体PGL3载体,构建PGL3-170、PGL3-326、PGL3-548和PGL3-594重组表达质粒。用脂质体介导的方法瞬时转染SKOV3细胞,测定荧光素酶的表达活性。结果成功构建4种人MUC16基因启动子片段的荧光素酶报告基因表达体系,分别为PGL3-170（-1420/-1250）、PGL3-326（-1576/-1250）、PGL3-548（-1798/-1250）和PGL3-594（-1844/-1250）,各缺失片段在SKOV3细胞中均有活性。MUC16的核心启动子5’端可能为PGL3-326的5’端,3’端固定在-1250处,5’端由-1844向-1420移动时启动子活性逐渐增强,但变化幅度不大,提示这一区间内不存在重要的顺式作用元件。结论成功构建了人MUC16基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,确定人MUC16基因的核心启动子可能区域。2:双启动子驱动的LfcinB基因慢病毒载体的构建目的构建了含MUG16基因启动子和HS OVCOV1双启动子的LfcinB基因复制型慢病毒。方法将靶向MUC16基因启动子和HS OVCOV1双启动子及LfcinB基因连接到慢病毒载体中,获得具有治疗作用的条件复制慢病毒MUC16HSOVCOV1-LfcinB统一质粒,PCR检测以及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过磷酸钙法共转染至包装细胞293LT,包装产生病毒液,并测定其滴度.结果PCR扩增和测序结果证实MUC1·6 HSOVCOV1-LfcinB核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1×10~5U/L.结论成功构建MUG16HSOVCOV1-LfcinB基因慢病毒载体,为研究其在卵巢癌细胞的功能和基因治疗奠定了基础.3;条件复制慢病毒MUC16 HSOVCOV1-LfcinB在体外对SKOV3细胞的治疗作用目的探讨MUC16 HS OVCOV1-LfcinB对体外培养的人卵巢癌细胞系SKOV3的抑制作用。方法用条件复制慢病毒MUC16 HS OVCOV1-LfcinB通过脂质体法瞬时转染SKOV3细胞,观察LfcinB对体外培养的人卵巢癌细胞系SKOV3细胞株的生长抑制作用,于24h,48h,72h观察细胞的生长情况。采用倒置显微镜,HE染色观察到细胞凋亡和生长抑制,流式细胞仪分析细胞凋亡率分别为6.57±0.12、12.3±0.45、22.9±0.73.结果MUC16 HS OVCOV1-LfcinB对体外培养的人卵巢癌细胞系SKOV3的生长有抑制作用,倒置显微镜HE染色,,观察到凋亡细胞典型的形态学特征,流式细胞仪检测到细胞凋亡率的变化。结论在体外,MUC16HSOVCOV1-LfcinB对体外培养的人卵巢癌细胞系SKOV3的生长有抑制作用,并可诱导其凋亡。·
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