研究背景:骨质疏松是一种常见的骨代谢疾病,其主要特征是骨量的丢失和骨微结构退化,进而导致骨的脆性增加,骨折风险增大。随着人口老龄化进程的加速,骨质疏松的发病率逐年增高,骨质疏松的预防和治疗成为当前亟待解决的一大公共卫生健康问题。由于常规的药物治疗不能完全治愈骨质疏松,且存在一定的毒副作用,使其临床应用受到一定限制。大量基础研究和临床研究都表明适宜的运动可促进骨生成、延缓老年骨质流失,起到防治骨质疏松的作用,WHO也将运动作为骨质疏松非药物治疗的重要手段之一,但其机制至今尚未完全明确。运动防治骨质疏松的机制研究主要从激素、细胞因子、信号通路等方面进行。近年来micro RNA在运动防治骨质疏松中的作用逐渐被发掘,miR-214被证明广泛参与骨代谢的调控。但尚未见有miR-214是否介导运动防治骨质疏松的在体动物研究。因此本研究将以miR-214为研究点,探究miR-214在运动促进骨生成、防治骨质疏松中的作用。研究方法:第一部分:运动对生长期和骨质疏松小鼠骨miR-214的表达和骨的影响（一）运动对生长期鼠骨miR-214的表达和骨的影响1、12只野生型雌性6周龄C57BL/6小鼠（生长期）随机分为对照组（Control,C）和运动组（Exercise,E）,每组6只。对照组常规饲养不进行任何干预。运动组进行为期6周的跑台运动干预,第一周速度为6m/min,之后速度每周增加1m/min,坡度始终为25°。每周运动5天,每天运动55min。最后一次干预结束后24小时取材。2、左侧股骨经4%PFA固定后用于micro CT检测,检测指标为BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp。右侧股骨用于骨生物力学检测,检测指标为最大强度、弯曲强度、断裂载荷、弹性模量、破坏应变。左侧胫骨提取总RNA用于RT-PCR检测,检测指标为miR-214、FGFR1、Osterix、ATF4、β-catenin。右侧胫骨提取总蛋白用于Western-blot检测,检测指标为ATF4和β-catenin蛋白的表达。（二）运动对骨质疏松小鼠骨miR-214的表达和骨的影响1、24只野生型雌性12周龄C57BL/6小鼠,随机分为4组:去卵巢组（OVX）和假手术组（SHAM）、去卵巢+运动组（OVX+EX）、假手术+运动组（SHAM+EX）,每组6只,非运动组常规饲养不进行任何干预,运动组进行为期9周的跑台运动干预,其中第一周为运动预适应,跑台速度为6m/min,时间为30min,跑台坡度为25°。之后2-9周为正式干预,跑台运动包括热身运动和正式干预,其中热身运动时间为5min,跑台速度为6m/min,坡度为25°,正式干预时间为55min,第二周速度为8m/min,之后速度每周增加1m/min,坡度为25°。每周运动5天。最后一次干预结束后取左右股骨胫骨进行相关指标检测。2、左侧股骨用于BMD和骨生物力学检测,右侧股骨用于miro CT检测,左侧胫骨提取总RNA用于RT-PCR检测,检测指标为miR-214、ATF4、β-catenin等RNA的表达。右侧胫骨提取总蛋白用于Western-blot检测,检测指标为ATF4、β-catenin蛋白的表达。第二部分:敲除BMSC中miR-214后对不同周龄小鼠骨及相关基因表达的影响1、选用Prrx1的Cre小鼠,与Mir214flox/+的flox小鼠进行杂交配对以获得在BMSC中特异性敲除miR-214的小鼠模型。本研究选取杂合子雌性基因敲除小鼠（Mir214-/+）用于实验,分别在选取12周龄（12W）、24周龄（24W）、36周龄（36W）的小鼠观察其骨骼指标及相关基因表达的变化,每组6只。2、左侧股骨经4%PFA固定后用于micro CT检测,检测指标为BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp。右侧股骨用于骨生物力学检测,检测指标为最大强度、弯曲强度、断裂载荷、弹性模量、破坏应变。左侧胫骨提取总RNA用于RT-PCR检测,检测指标为miR-214、FGFR1、Osterix、ATF4、β-catenin。右侧胫骨提取总蛋白用于Western-blot检测,检测指标为Osterix、ATF4和β-catenin蛋白的表达。第三部分:运动和去卵巢对miR-214基因敲除小鼠骨及相关基因表达的影响1、选用24只24周龄雌性杂合子基因敲除小鼠,随机分为去卵巢组（OVX）、假手术组（SHAM）、去卵巢+运动组（OVX+EX）、假手术+运动组（SHAM+EX）,每组6只。以12只同性别非基因敲除小鼠作为阴性对照,随机分为去卵巢组（OVX）、假手术组（SHAM）,每组6只。去卵巢手术和假手术操作同实验一第二部分实验。术后4周进行为期1周的运动预适应,跑台速度为6m/min,时间30min,跑台坡度25°。之后进行为期8周的运动干预,运动干预包含热身运动和正式运动两部分,其中热身运动均为6m/min,时间为5min,跑台坡度为25°;正式运动部分第一周速度为8m/min,跑台时间为55min,坡度为25°。之后速度每周增加1m/min。对照组小鼠常规饲养,不进行任何干预。每周一称取小鼠体重,并做好记录。2、左侧股骨经4%PFA固定后用于micro CT检测,检测指标为BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp。右侧股骨用于骨生物力学检测,检测指标为最大强度、弯曲强度、断裂载荷、弹性模量、破坏应变。左侧胫骨提取总RNA用于RT-PCR检测,检测指标为miR-214、FGFR1、Osterix、ATF4、β-catenin。右侧胫骨提取总蛋白用于Western-blot检测,检测指标为Osterix、ATF4和β-catenin蛋白的表达。研究结果:第一部分:运动对生长期和骨质疏松小鼠骨miR-214的表达和骨的影响（一）运动对生长期鼠骨miR-214的表达和骨的影响1、跑台运动未对生长期小鼠的体重产生显著影响,micro CT和骨生物力学指标显示:跑台运动显著提高生长期小鼠的骨量、骨小梁厚度并降低骨小梁的数量,同时对其骨生物力学指标的提高起到一定的促进作用。2、RT-PCR和Western-blot指标显示:跑台运动显著抑制生长期小鼠骨miR-214的表达,同时显著提高FGFR1、Osterix、ATF4、β-catenin等基因的表达。（二）运动对骨质疏松小鼠骨miR-214的表达和骨的影响1、去除卵巢后小鼠的体重显著增加,而跑台运动可以显著降低去卵巢小鼠的体重。此外跑台运动显著提高骨质疏松小鼠的骨量,降低其骨小梁分离度,并且骨质疏松小鼠骨的骨生物力学指标也呈现一定上升趋势。2、去除卵巢后小鼠骨miR-214的表达显著增高,跑台运动可以显著降低骨质疏松小鼠骨miR-214的表达。且通过RT-PCR和Western-blot检测结果显示ATF4和β-catenin基因的表达在骨质疏松小鼠经过运动后显著升高。第二部分:敲除BMSC中miR-214后对不同周龄小鼠骨及相关基因表达的影响1、micro CT检测结果显示,在BMSC中敲除miR-214后基因敲除小鼠的骨量在12W、24W、36W时均显著升高,且骨小梁的厚度也出现显著升高的趋势。此外基因敲除小鼠的最大载荷和弯曲强度在24W和36W时均显著升高,基因敲除小鼠的破坏应变在12W和36W时显著提高。2、RT-PCR检测结果显示在基因敲除小鼠BMSC中miR-214的表达和12W、24W、36W基因敲除小鼠骨中miR-214的表达均显著降低。3、RT-PCR和Western-blot指标显示miR-214基因敲除小鼠在12W、24W、36W时其骨中Osterix、ATF4、β-catenin、FGFR1等基因的表达均显著增高。第三部分:运动和去卵巢对miR-214基因敲除小鼠骨及相关基因表达的影响1、阴性对照和基因敲除小鼠在去除卵巢后其体重均显著增加,而跑台运动可以显著降低基因敲除去卵巢小鼠的体重。micro CT和骨生物力学检测结果发现:基因敲除小鼠的骨量和骨强度显著高于阴性对照小鼠,阴性对照和基因敲除小鼠去除卵巢后其骨量和骨强度均显著降低,经过9周的跑台运动干预后基因敲除去卵巢小鼠和假手术小鼠的骨量和骨强度显著增加。2、RT-PCR检测结果显示:基因敲除小鼠的骨miR-214表达显著低于阴性对照小鼠。去除卵巢后基因敲除小鼠的骨miR-214表达显著增加,而经过9周的跑台运动干预可减少去除卵巢导致的骨miR-214表达增加。3、RT-PCR和Western-blot结果显示:在基因敲除小鼠中,卵巢去除降低了其骨Osterix、FGFR1、ATF4和β-catenin等m RNA和蛋白的表达,在经过9周的运动干预后上述基因的表达在miR-214基因敲除去卵巢小鼠中的表达。同时基因敲除小鼠假手术小鼠的骨Osterix、FGFR1、ATF4和β-catenin等基因的表达高于阴性对照小鼠,而且跑台运动可进一步提高上述基因的表达。研究结论:1、运动可降低miR-214在生长期小鼠和骨质疏松小鼠骨中的表达,促进骨形成相关基因的表达,从而提高其骨量。2、BMSC中的miR-214在骨生成中起到负调控作用,敲除miR-214后可提高相关基因的表达,并使小鼠在不同周龄时的骨量和骨强度得到提高。3、运动可通过降低miR-214的表达,在一定程度上减少卵巢去除导致的小鼠（miR-214基因敲除小鼠）骨量的流失,从而起到防治骨质疏松的用。