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在A型流感病毒中,H3亚型宿主广泛,不仅感染禽类,还感染猪、马、犬等哺乳动物甚至人类,对畜牧业生产和公共卫生安全均构成重要威胁,有必要进行持续的流行病学监测。本研究基于2017年～2019年华东地区活禽交易市场(live poultry market,LPM)的低致病性禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)流行病学调查,对其中分离鉴定的H3亚型AIV进行了全基因组遗传进化分析与HA基因的密码子使用偏好性分析,并挑选代表毒株进行了部分生物学特性的测定。研究结果将丰富我国低致病性AIV的基础数据资源,并为AIV的跨种传播机制研究提供一定参考。1.2017-2019年华东地区低致病性禽流感病毒流行病学调查及H3亚型禽流感病毒的分离鉴定2017年9月至2019年6月,对华东地区LPM进行低致病性AIV流行病学监测,共采集源自江苏、安徽、山东等省份的家禽泄殖腔、喉头棉拭样品及LPM环境水样1866份。经鉴定,共有346份阳性样品,分布于109个禽群;总的阳性率为18.54%,群阳性率为44.67%。从阳性样品中HA亚型分布来看:阳性率最高的为H9(72.83%,252/346),其次为H3(26.59%,92/346),还各有1株H1与H10病毒。从不同宿主中各亚型AIV阳性样品数量来看:鸡中H9亚型阳性率最高,为96.80%(242/250),剩余均为H3亚型;鸭中H3亚型阳性率最高,为91.76%(78/85),其次是H9亚型,为5.88%(5/85),另各有1.17%(1/85)的H1与H10亚型;鹅中检测到H3与H9亚型,两者阳性率相同,均为(50%,5/10);环境水样中仅分离到1株H3亚型AIV。从不同月份AIV的阳性数量来看,夏秋季也有较多的低致病性AIV,未表现出明显的季节性。进一步地,对共分布于28个群的H3亚型阳性样品进行了病毒纯化及HA与NA基因的PCR鉴定,结果显示,28株H3亚型AIV全部为H3N2亚型。表明,华东地区禽群中广泛存在有H9、H3等亚型低致病性AIV,其中H3亚型在鸭群中优势明显且均为H3N2亚型。2.H3N2亚型禽流感病毒遗传进化分析根据时空、宿主差异,我们从第一章分离的H3N2亚型AIV中选取19株代表性病毒进行全基因组测序与遗传进化分析。经分析,PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因的系统发生树中,19株H3N2病毒均位于欧亚谱系,与野禽中的流感病毒高度同源,而与猪、马、犬等哺乳动物来源以及人源流感病毒的遗传距离均较远,提示H3N2病毒从禽直接传播到哺乳动物的风险较低。此外,部分H3N2亚型AIV的PB1基因与H5N6亚型流感病毒聚类成簇,提示两者之间可能发生了重配。HA蛋白的裂解位点模式均为PEKQTR↓GLF,符合低致病性AIV的分子特征;与受体嗜性相关的第226和228位均分别为Q和G,可能仍主要结合禽类受体,但1株病毒(180138)出现G225D突变,值得后续深入研究。内部基因的关键氨基酸位点分析中,并未出现诸如PB2的E627K、D701N等对哺乳动物致病性增强的分子标记。为了探究H3N2亚型AIV是否可能与跨宿主感染相关,我们从密码子使用偏好性的角度,对已测序的19株分离株以及NCBI数据库中检索的人源(n=60)、犬源(n=55)、猪源(n=54)、马源(n=21)等不同宿主来源H3病毒进行HA基因的相关分析。核苷酸成分及相对同义密码子使用性分析表明,各宿主来源H3病毒的HA基因中AU均含量高于GC,偏好使用A/U结尾的密码子。HA基因的有效密码子数在不同宿主中的平均值范围为47.10±1.64～53.22±0.33,表明密码子的使用模式存在一定偏好性,但偏好性较低。中性分析结果提示,HA基因形成密码子偏好性的过程中,各宿主来源H3病毒受到自然选择的作用均大于突变压力,分别为:禽源,95.65%&4.35%;人源,68.75%&31.25%;犬源,73.17%&26.83%;猪源,60.74%&39.26%;马源,63.57%&36.43%。对应性分析中,HA基因总体呈现按宿主聚类的趋势,但禽源H3与哺乳动物来源的病毒差异较明显,一定程度表明H3N2亚型AIV从禽直接跨种感染其他哺乳动物的可能性较低。3.6株H3N2亚型AIV的生物学特性分析根据第二章全基因测序的19株H3N2亚型AIV在系统发生树中的不同分支分布,进一步选取 171029、180133、180562、181222、190566 和 180138(HA-G225D)共6株病毒,对其体内/外感染性、热/酸稳定性等部分生物学特性进行测定。6株病毒的EID50为107.000～108.500,表明在鸡胚上均能较好地繁殖。不同细胞上的TCID50数值显示,6株病毒在MDCK(104.769～106.000)上的复制性能均高于A549(101.500～102.571)和CEF(103.289～104500)细胞;但MDCK细胞上形成空斑的数量与大小在6株病毒间存在差异。热稳定性试验中,180133为热不稳定性、180562为中等热稳定性,其余病毒均为热稳定性;但经56℃热处理10min后,除190566之外,5株病毒均丧失了对MDCK细胞的感染性。酸稳定性试验中,待测病毒经pH 4.0～7.0缓冲液处理后,均仍具有对MDCK细胞的感染能力。以106.0EID50病毒量滴鼻接种6周龄BALB/c小鼠,14天观察期内所有小鼠均存活且体重总体呈增长趋势,仅171029、180133、180562这3株病毒可在攻毒后第5天小鼠肺脏中检测到有限的病毒复制,表明测定的6株H3N2亚型AIV对小鼠均为低致病性。综上所述,H3N2亚型AIV目前在活禽市场鸭群中的阳性率较高,其PB1基因可能参与了同期H5N6病毒的基因重配;各基因的遗传进化分析与HA基因密码子偏好性分析均提示其跨种感染其它哺乳动物的潜能较低;禽源H3N2病毒尚未表现出对哺乳动物模型小鼠的高致病力,但病毒热稳定性的增加可能促进其进一步传播与变异,仍需继续加强监测工作。