甘蓝型油菜ATP结合盒转运基因BnABCI8的功能研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jayden1986
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成熟叶绿体是高等植物光合作用的主要场所,对叶绿体发育相关基因的研究是探讨叶绿体发育机理与功能的重要手段,也可以挖掘作物光合作用的潜力,从而增加作物产量。据研究,ABC转运蛋白参与植物生长发育的许多过程,其中一些ABCI亚族蛋白与叶绿体发育紧密相关,而目前在甘蓝型油菜中尚无ABCI亚族成员的报道。本研究以甘蓝型油菜Bn ABCI8为研究对象,分析了其分子特征、保守结构域、组织表达模式、亚细胞定位等,并创建了功能缺失突变体,随后探索了该基因在甘蓝型油菜中所扮演的角色。主要结果如下:(1)拟南芥中ABCI亚族成员有21个,甘蓝型油菜中有50个,且ABCI亚族成员分散在较远的进化树枝上,成员之间可能有着不同的功能。甘蓝型油菜的ABCI蛋白均为可溶性ABC转运蛋白,其中Bn ABCI8不含TMD结构域但含有保守的SUFBD结构域,说明Bn ABCI8可能不具备跨膜转运的功能,可能与叶绿体铁硫簇的组装有关。通过分析Bn A09.ABCI8基因的启动子序列,发现有多个光响应元件,说明Bn ABCI8可能通过光诱导来调节植物的生长发育。(2)Bn A09.ABCI8与Bn C09.ABCI8为Bn ABCI8在甘蓝型油菜中的2个功能拷贝,它们在各个组织中均有表达,且表达模式相似,均在花和叶中有较高的表达,在根和茎中表达量较低。亚细胞定位结果表明,Bn A09.ABCI8蛋白与Bn C09.ABCI8蛋白均定位于叶绿体,说明它们可能参与维持叶绿体的正常功能。(3)利用CRISPR/Cas9技术获得了Bn A09.ABCI8和Bn C09.ABCI8均被编辑的纯合双突变体以及只有Bn A09.ABCI8被编辑的纯合单突变体。单突变体以及双突变体均表现出黄色的子叶和褪绿的真叶,长势弱,而双突变体褪绿的程度以及弱长势的情况更为严重。根据透射电镜观察,双突变体中叶绿体的数目和形态都表现出异常且无完整的类囊体膜。(4)通过q RT-PCR检测,发现双突变体中叶绿素合成途径相关基因的表达量显著减少,说明Bn ABCI8的突变影响了叶绿素的生物合成。通过火焰原子吸收光谱仪测定,突变体叶片中Fe离子大量积累,说明Bn ABCI8可能参与到维持甘蓝型油菜叶片的Fe稳态。综上,本文结果表明,Bn ABCI8的突变造成了甘蓝型油菜叶色缺绿。Bn ABCI8为叶绿体蛋白,其基因在叶中高表达,Bn ABCI8的突变造成叶片叶绿体结构不完整,叶绿素合成途径受到影响,并且在叶片中积累大量的Fe离子,而Fe离子的积累又可能会引发一系列的反应,如活性氧积累,细胞死亡和叶绿素的降解等,最终造成了甘蓝型油菜叶色的突变。
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