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背景:PM2.5可导致气道上皮损伤,并与哮喘的急性加重密切相关,但是其具体作用机制尚未完全阐明。正常的气道上皮细胞表面覆盖着一层液体表层,适当的气道表面液体组分和厚度是发挥气道黏液水合和纤毛摆动的关键,主要由环磷酸腺苷调控的囊性纤维化跨膜转导调节因子（Cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR）氯通道和气道上皮细胞自分泌的ATP激活P2Y2受体介导的钙依赖的氯离子通道两条途径调节。气道表面液体水合减少和黏液高分泌会导致气道阻塞,是哮喘的重要病理特征。本研究以嘌呤能P2Y2受体为研究靶点,从分子水平探讨PM2.5对气道上皮细胞表面液体层生理功能的影响,为进一步阐明PM2.5导致呼吸道疾病的致病机制及其防治提供新思路和新靶点。目的:（1）通过建立PM2.5暴露的气道上皮细胞气-液相界面（transwell）体外共培养模型,探索PM2.5对气道上皮细胞的气道表面液体层分泌和阴离子短路电流的影响。（2）通过建立PM2.5暴露的气道上皮细胞普通体外共培养模型,以P2Y2受体为研究靶点,分别采用P2Y受体的兴奋剂ATP和抑制剂苏拉明,探讨PM2.5对气道上皮细胞表面液体层分泌的分子调控机制。方法:（1）设立六个实验分组:空白对照组、ATP组（10 μM）、苏拉明组（100 μ M）、PM2.5（100 μ g/ml）组、ATP+PM2.5组、苏拉明+PM2.5组。（2）将复苏好的Calu-3细胞接种在transwell培养板,培养14-21天直至铺满半透膜,分别加入刺激物培养24小时（连续3个24小时）,体积计数法测定各组液体分泌体积;跨单层上皮细胞短路电流技术测定各实验组跨单层上皮细胞阴离子短路电流水平,以说明PM2.5对气道上皮细胞气道表面液体层的生理功能的影响,;（3）将复苏好的Beas-2b细胞接种于普通六孔板培养至60-70%密度,分别加入刺激物培养12小时、24小时和36小时,荧光定量PCR（qPCR）测定P2Y2受体mRNA相对表达;蛋白免疫印迹（western blot）测定24小时、48小时和72小时的P2Y2受体和CFTR的蛋白表达差异;采用细胞流式技术测定24小时内各实验组的细胞内钙荧光强度,以阐明PM2.5对气道上皮细胞表面液体层生理功能影响的分子作用机制。结果:（1）气道表面液体:ATP组液体分泌量显著高于空白对照组,差异有统计学意义（P＜0.001）,PM25组、苏拉明组、ATP+PM2.5组和苏拉明+PM2.5组液体分泌量均显著低于空白对照组（P＜0.01）。此外,ATP+PM2.5组液体分泌量显著低于ATP组（P＜0 001）。说明气道上皮细胞可分泌一定量的气道表面液体,外源性ATP可刺激气道表面液体分泌增多,P2Y受体抑制剂苏拉明和PM2.5抑制气道表面液体的分泌。（2）跨上皮细胞短路电流:空白对照组显示一稳定而无峰值的基础电流,ATP组较空白对照组出现快速上升的电流峰值（P＜0 01）,而苏拉明+ATP组、PM2.5+ATP组的短路电流峰值和达峰平均速度均显著地低于ATP组（P＜0.01）。说明正常的气道上皮细胞具有维持基础的电流能力并受ATP刺激后电流峰值上调,以保障气道上皮的自身生理功能,而加入PM2.5或苏拉明后,外源性ATP诱导的短路电流峰值受到抑制。（3）P2Y2-mRNA表达:a.12小时组:ATP组、苏拉明组的P2Y2-mRNA表达与空白对照组比较均无显著性差异（P＞0.05）,而PM2.5组、ATP+PM2.5组、苏拉明+PM2.5组的P2Y2-mRNA表达均显著低于对照组（P＜0.05）,ATP+PM2.5组与ATP组相比无统计学意义（P＞0 05）。b.24小时组:ATP组、苏拉明组的P2Y2-mRNA表达均显著高于空白对照组（P＜0.05）,而PM2.5组、ATP+PM2.5组、苏拉明+PM2.5组的P2Y2-mRNA均显著低于空白对照组（P＜0.05）。此外,ATP+PM2.5组低于ATP组（P＜0.05）。c.36小时组:ATP组的P2Y2-mRNA显著高于空白对照组（P＜0 001）,而苏拉明组、PM2.5组、ATP+PM2 5组和苏拉明+PM2.5组的P2Y2-mRNA均显著低于空白对照组（P＜0.05）;ATP+PM2.5组低于ATP组,差异有统计学意义（P＞0.05）。说明气道上皮细胞在外源性ATP刺激后可上调P2Y2受体基因表达,而苏拉明和PM2.5下调气道上皮细胞的P2Y2受体基因表达。（4）P2Y2和CFTR蛋白表达:a.24小时组:ATP组的P2Y2R和CFTR蛋白表达与空白对照组无显著性差异（P＞0.05）,而苏拉明、PM2.5组、ATP+PM2.5组、苏拉明+PM2.5组的P2Y2R和CFTR蛋白表达均显著低于空白对照组（P＜0.01）。此外,ATP+PM2.5组的P2Y2R和CFTR蛋白表达明显低于ATP组（P＜0.01）。b.48小时组和72小时组:ATP组的P2Y2R和CFTR蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05）),而苏拉明组、PM2.5组、ATP+PM2.5组、苏拉明+PM2.5组的P2Y2R和CFTR蛋白表达均显著低于对照组（P＜0.05）,且ATP+PM2.5组低于ATP组,差异有统计学意义（P＜0.01）。说明气道上皮细胞在外源性ATP刺激48小时后可上调P2Y2受体和CFTR蛋白表达,而苏拉明和PM2.5可下调气道上皮细胞的P2Y2受体和CFTR蛋白表达。（5）细胞内钙荧光强度:ATP组的细胞内钙荧光强度显著高于对照组（P＜0.01）,而PM2.5组、苏拉明组、ATP+PM2.5组、苏拉明+PM2.5组的细胞内钙荧光强度与空白对照组相比无显著性差异（P＞0.05）。苏拉明组、PM2.5组、ATP+PM2.5组、苏拉明+PM2.5组的细胞内钙荧光强度均显著低于ATP组（P＜0.01）。说明气道上皮细胞内可释放一定水平的钙,外源性ATP可刺激细胞内钙的显著增加,而加入苏拉明或PM2.5后,ATP诱导的细胞内钙水平受到显著抑制。结论:1、PM2.5暴露能抑制ATP诱导的气道上皮细胞气道液体表层和阴离子电流的分泌。2、PM2.5可能通过下调P2Y2受体基因和蛋白水平的表达而抑制CFTR表达和ATP诱导的细胞内Ca2+的释放,降低气道上皮细胞的表面液体层和离子短路电流的分泌,从而破坏气道上皮细胞的液体层生理功能。