胃癌（Gastric cancer,GC）是继乳腺癌、肺癌、结直肠癌和前列腺癌之后的全球第五大常见癌症,也是癌症相关死亡的第四大原因。胃癌拥有复杂的肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）,其中的肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts,CAFs）通过一系列的信号通路从结构和功能两方面影响着细胞癌变、肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成、细胞外基质重塑、肿瘤侵袭转移及抗肿瘤免疫等。CAFs的来源众多,仍不清楚胃癌细胞能否促进正常成纤维细胞向TME迁移,进而诱导CAFs形成。以免疫检查点抑制剂为代表的癌症免疫治疗通过增强效应T细胞的功能,抑制调节性T细胞的活性,从而控制肿瘤的进展。免疫治疗已经显著改善了包括胃癌在内的多种晚期癌症的预后,但仅有少数患者可以通过免疫治疗获得长期的疾病控制。研究发现,CAFs诱导的免疫抑制是免疫检查点抑制剂耐药的重要原因。因此,对胃癌相关成纤维细胞的深入研究可为改善免疫治疗疗效提供新的思路。本课题首先基于公共数据库验证了 CAFs在胃癌中的预后意义,并筛选出成纤维细胞迁移的关键基因TNS1,进而提出胃癌细胞可上调成纤维细胞TNS1的表达,从而促进成纤维细胞迁移的科学假设,并通过细胞功能学实验予以初步验证。本课题也发现胃癌细胞上调成纤维细胞TNS1表达的机制可能与外泌TGFβ1有关。更重要的是,TME中TNS1 mRNA表达水平与免疫治疗效果密切相关。本课题初步揭示了 TNS1在胃癌促进成纤维细胞迁移中的作用,为识别免疫治疗适宜人群、预测胃癌免疫治疗效果提供了潜在的生物学标志物,有利于胃癌精准治疗的发展。第一部分CAFs与胃癌的临床相关性研究背景:CAFs促进肿瘤发生发展,其在TME中的数量影响肿瘤患者的预后和治疗效果。但是,CAFs与胃癌临床病理特征及预后的关系仍知之甚少。目的:基于胃癌基因表达谱,分析胃癌组织中浸润性CAFs的丰度及其临床意义,为进一步的CAFs相关基因研究提供依据。方法:1)研究对象:癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）及亚洲癌症研究组（Asian Cancer Research Group,ACRG）数据库中的胃癌病例。2)量化CAFs在TME中的丰度:通过微环境细胞成分计算器（The Microenvironment Cell Populations-counter,MCP-counter）对胃癌转录组数据进行CAFs浸润丰度的量化。3)临床相关性分析:分析CAFs浸润丰度与临床病理特征的关系,生存分析及多因素Cox回归分析CAFs浸润丰度与胃癌预后的关系。结果:1)患者的临床病理特征:经入排筛选,本研究共纳入300例ACRG和348例TCGA的胃癌病例。ACRG队列的老年患者（≥65岁）比例显著低于TCGA队列（p=0.007）,而其它临床病理特征在两组间无显著差异（p＞0.05）。2)CAFs丰度与胃癌组织学分级相关:ACRG队列的CAFs瘤内丰度在组织学分级Ⅲ级胃癌中显著高于Ⅰ/Ⅱ级（p=3.7e-09）,在Ⅲ/Ⅳ期胃癌中显著高于Ⅰ/Ⅱ期（p=7.7e-06）,在女性胃癌中显著高于男性（p=0.025）。TCGA队列的CAFs瘤内丰度同样在组织学分级Ⅲ级胃癌中显著高于Ⅰ/Ⅱ级（p=0.007）,但与性别和分期并无显著关联（p＞0.05）。3)高CAFs丰度胃癌患者预后较差:在ACRG胃癌队列中,高CAFs丰度胃癌的中位OS为23.4月,显著劣于低CAFs丰度胃癌（中位OS未达到;p＜0.0001）。在TCGA胃癌队列中,高CAFs丰度胃癌的中位OS为25.0月,同样显著劣于低CAFs丰度胃癌的69.0月（p=0.005）。4)高CAFs丰度是胃癌不良预后的独立预测因素:在ACRG胃癌队列中,高CAFs丰度（HR=1.98,95%CI:1.37-2.85,p＜0.001）是胃癌不良预后的独立预测因素,与TCGA胃癌队列中的结果一致（HR=1.60,95%CI:1.14-2.24,p=0.006）。结论:CAFs在TME的浸润丰度与胃癌组织学分级相关,高CAFs丰度胃癌患者预后较差,是胃癌不良预后的独立预测因素。第二部分 CAFs浸润的关键调控基因筛选研究背景:肿瘤细胞通过多种机制促进正常成纤维细胞向CAFs转化,但相关机制存在瘤种间差异。同时,肿瘤个体对CAFs作用的依赖程度不尽相同,表现为CAFs的浸润丰度在不同样本间存在显著差异。目前,影响CAFs瘤内浸润水平的因素仍不清楚。目的:通过对胃癌转录组数据分析,筛选出影响CAFs浸润且在CAFs特异性高表达（与胃癌细胞相比）的关键基因,为胃癌细胞调控CAFs浸润的进一步研究提供靶点。方法:1)差异基因分析（Differentially expressed genes,DEGs）分析:使用R包limma进行CAFs浸润水平高低胃癌间的DEGs分析。2)加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）:通过WGCNA对上述DEGs进行聚类,筛选出与TME评分（TMEscore）高度相关的基因集。3)随机森林模型:评价经WGCNA筛选的基因对TMEscore的重要性。4)Cox回归:对随机森林模型筛选出的重要基因与OS的关系进行分析。5)交集分析:以fibroblast为关键词,在基因本体论（Gene ontology,GO）网站检索,将与成纤维细胞迁移有关的基因与上述对预后影响最显著的基因取交集。6)细胞类型相关的基因表达分析:使用大体（Bulk）测序和单细胞测序数据分析相关基因分别在胃癌细胞及CAFs中的表达量,并验证相关基因与CAFs浸润丰度的相关性。结果:1)CAFs浸润水平相关的DEGs:ACRG胃癌队列中CAFs丰度为上四分位和下四分位的样本各有75例,比较两组间基因表达谱,得到符合标准的DEGs一共738个。2)核心基因集:738个DEGs经WGCNA聚类为3类,即蓝色（blue）、灰色（grey）和绿松石色（turquoise）3个基因模块,其中绿松石色模块与TMEscore拥有最高最显著的相关性,为核心基因集。3)基因重要性评价:随机森林模型分析绿松石色模块内的611个基因表达对TMEscore影响的重要性,其中有统计学显著性的基因共91个。4)预后影响最显著的基因:针对随机森林筛选的重要基因,进一步在ACRG胃癌队列中筛选出预后影响最显著的10个基因,并在TCGA胃癌队列中验证了这些基因的预后作用。5)TNS1是调控CAFs浸润的潜在关键基因:在GO网站检索发现与CAFs迁移有关的4个生物学功能基因集,去重后一共包含19个基因,与上述预后影响最显著的10个基因取交集,发现TNS1是唯一的交集基因。6)TNS1主要由CAFs表达:基于TCGA胃癌队列中癌和癌旁正常组织配对、有TNS1表达数据及CAFs丰度值的28对样本进行分析,发现TNS1的mRNA表达在癌组织中显著低于配对的癌旁正常组织（p=0.012）,这种差异主要出现于CAFs浸润丰度低的癌组织中（p＜0.001）,却未发现于CAFs浸润丰度高的癌组织中（p=0.9）。基于GSE139829的单细胞测序数据,我们进一步发现TNS1的mRNA表达在CAFs中显著高于癌细胞（p＜0.001）。7)TNS1与CAFs浸润丰度正相关:在ACRG和TCGA两个胃癌队列中均发现CAFs在肿瘤中的丰度与TNS1 mRNA表达呈显著正相关（ACRG:R=0.76,p＜2.2e-16;TCGA:R=0.78,p＜2.2e-16）。在GSE134520胃癌前病变的单细胞测序数据中,同样发现CAFs在组织中的占比与TNS1 mRNA表达呈正相关（R=0.58,p=0.17）,但由于样本量较小而没有显著性（N=6）。结论:TNS1是潜在的成纤维细胞迁移关键基因,且主要由CAFs表达。第三部分成纤维细胞迁移关键基因TNS1的验证及机制探索研究背景:TNS1属于紧张素粘着家族,在纤维粘附、细胞运动及信号转导等方面起主要作用。目前研究已证实TNS1参与小鼠胚胎成纤维细胞的迁移。然而TNS1对胃癌中成纤维细胞迁移的影响及其具体机制仍不清楚。目的:通过细胞功能实验,证实胃癌细胞可通过上调成纤维细胞TNS1表达促进其迁移,并探索相关机制。方法:1)成纤维细胞迁移试验和TNS1检测:将胃癌细胞系HGC-27和AGS与人正常成纤维细胞系CCC-ESF-1共培养,Western blot分析成纤维细胞TNS1表达变化。分别将正常培养基及胃癌细胞培养基加入成纤维细胞培养环境,Transwell细胞迁移实验观察成纤维细胞迁移速率变化,并研究敲减TNS1基因表达的影响。2)基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）:对TNS1 高低表达组间的DEGs进行GSEA。3)外泌TGFβ1的检测:通过ELISA检测CCC-ESF-1、胃癌细胞及CCC-ESF-1+胃癌细胞共培养体系培养液中外泌TGFβ1含量。4)抑制TGFβ1受体:研究TGFβI型受体抑制剂对胃癌细胞促成纤维细胞迁移的影响。Western blot研究TNS1表达的相应变化。结果:1)胃癌细胞促进成纤维细胞迁移和表达TNS1:与胃癌细胞共培养后成纤维细胞迁移数量增加（p＜0.0001和p＜0.001）,且成纤维细胞中TNS1表达上调。2)敲减成纤维细胞的TNS1表达抑制胃癌细胞诱导的迁移:敲减TNS1表达后成纤维细胞迁移数量减少（p＜0.05和p＜0.0001）,且抑制了胃癌细胞诱导的成纤维细胞迁移（p＜0.0001）。3)胃癌细胞可能通过TGFβ信号调控成纤维细胞表达TNS1:GSEA发现TGFβ和其受体信号相关基因在TNS1高表达组中显著富集,而TGFβ可由胃癌细胞外泌并作用于成纤维细胞,提示TGFβ信号通路可能调控TNS1的表达。4)胃癌细胞和成纤维细胞共培养增加TGFβ1的外泌:共培养后TGFβ1外泌量增加,显著高于胃癌细胞及成纤维细胞单独培养时的外泌量,并高于两者单独培养外泌量之和（p＜0.01）。5)抑制TGFβ1受体抑制胃癌细胞诱导的成纤维细胞迁移和TNS1表达:TGFβI型受体抑制剂抑制胃癌细胞诱导的成纤维细胞迁移（p＜0.0001）,且胃癌细胞诱导的TNS1表达下调。结论:胃癌细胞通过上调成纤维细胞TNS1的表达促进其迁移,机制可能与胃癌细胞外泌TGFβ 1对成纤维细胞的作用有关。第四部分TNS1与胃癌免疫特征及免疫治疗效果的关系研究背景:免疫治疗的总体有效率仍然较低,尤其是在后线治疗中。目前发现,PD-L1高表达、微卫星不稳定（Microsatellite instability,MSI）或高肿瘤突变负荷（Tumor mutation burden,TMB）的患者常常对免疫治疗较敏感。但是,这些疗效分子标志物也存在应用上的不足,亟待寻找新的分子标志物以进一步提高对免疫治疗优势人群的筛选。目的:通过研究TNS1与胃癌免疫相关标志的关系,以及TNS1对胃癌免疫治疗效果的影响,为胃癌免疫治疗提供新的疗效预测标志物。方法:1)免疫标志:计算ACRG和TCGA胃癌样本的TMB,并分析MSI状态。2)免疫细胞浸润分析:通过xCell算法计算TME中免疫细胞浸润的丰度。对江苏大学附属医院8例有转录组数据的胃癌样本进行多重免疫荧光染色（Multiple-immunofluorescence,mIF）分析。3)抗PD-1抗体应答（Response）的预测:基于转录组数据,使用肿瘤免疫功能障碍和排除（Tumor immune dysfunction and exclusion,TIDE）算法对TCGA 胃癌样本的免疫治疗应答进行预测。4)免疫治疗队列:一是帕博利珠单抗（Pembrolizumab）治疗转移性胃癌2期临床研究的韩国队列,二是阿替利珠单抗（Atezolizumab）治疗转移性尿路上皮癌2期临床研究的IMvigor210队列。接受者操作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）及其曲线下面积（The areas under the curves,AUC）用以评价TNS1 mRNA表达对免疫治疗应答的预测能力。生存分析采用Kaplan-Meier方法及log-rank检验。结果:1)TNS1与胃癌免疫标志的相关性:在ACRG和TCGA胃癌样本中,TNS1的mRNA表达均与TMB显著负相关（p＜0.0001）,且微卫星稳定型的TNS1 mRNA表达均显著高于MSI型（p＜0.0001）。2)TNS1与胃癌免疫细胞浸润的相关性:在ACRG和TCGA中,TNS1 mRNA表达均与NK细胞和Th1细胞的浸润丰度呈显著负相关（p＜0.05）。对江苏大学附属医院样本的mIF分析显示,TNS1 mRNA表达与肿瘤实质中的M2巨噬细胞的浸润数量呈正相关,与M1巨噬细胞、NK细胞、NK细胞亚型CD56bright及CD56dim的浸润数量均呈负相关。3)TNS1与免疫治疗效果的关系:在TCGA、韩国及IMvigor210队列中,ROC曲线显示TNS1 mRNA表达预测免疫治疗应答的AUC分别0.793、0.801及0.632。以最大ROC曲线值对应的TNS1表达最佳阈值分界,TNS1高表达者的客观有效率分别为14.5%、4.8%及13.1%,均显著低于TNS1低表达者的56.9%、45.8%及32%（均p＜0.001）。在拥有总生存（Overall survival,OS）数据的IMvigor210队列中,TNS1 mRNA高表达者的OS也显著劣于低表达者（p=0.037）。结论:TNS1与胃癌免疫特征密切相关,其高表达提示胃癌免疫治疗效果较差。