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背景与目的目前,肺癌的发病率与死亡率仍居高不下,占全球恶性肿瘤的首位,其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌总数的80%左右,肺腺癌是其最主要和最常见的亚型。由于肺癌往往起病比较隐匿,缺少特异性症状,我国约70%~80%的肺癌患者在确诊时已属晚期,难以行根治性手术切除;以化放疗、靶向治疗为主的内科治疗手段,因其耐药等问题疗效仍欠理想,预后普遍较差。因而,深入研究肺癌发生发展的分子生物学机制,探寻肺癌诊治中的新靶点具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类保守的内源性非编码RNA,其大小约22个核苷酸,参与机体的多种病理生理过程。有研究表明,肺癌的发展过程中存在着多种miRNA基因的突变,以及在肺癌组织和癌旁组织中发现miRNA的表达存在差异,另外,某些miRNA在肺癌的发展进程中起着特殊作用。微小RNA-146a(microRNA-146a,miR-146a)是研究最为广泛的miRNA之一,在胃癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤中研究较为深入,作用较为明确;但在肺癌中所起的作用及其机制尚待研究。本研究以人肺腺癌细胞株为研究对象,检测各株细胞miR-146a的表达情况;同时研究miR-146a对人肺腺癌细胞的恶性生物学行为的影响,并探究miR-146a作用的靶基因,研究其机制,为肺腺癌的诊疗提供新的潜在靶点。方法1.实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)实验检测miR-146a在三株人肺腺癌A549、H1299、PC-9以及人正常肺上皮细胞BEAS-2B中的表达。2.选取合适的人肺腺癌细胞株作为研究对象;转染miR-146a mimics或者inhibitor作为实验组,转染miR-146a mimics或者inhibitor无义序列作为nc对照组,只加入转染试剂lip2000的组为mock空白组。转染6小时后于荧光显微镜下观察大致转染效率;转染48小时后采用RT-qPCR实验检测miR-146a的表达倍数。3.通过CCK8实验、流式凋亡检测实验、Transwell侵袭实验以及划痕实验检测miR-146a对人肺腺癌细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等恶性生物学行为的影响。4.采用生物信息学软件Targetscan、miRDB对miR-146a靶基因进行预测,通过检索大量的文献选取适合的靶基因,用双荧光素报告酶基因验证miR-146a与靶基因之间是否存在靶向调控关系。5.通过RT-qPCR及蛋白质印迹(Western blot,WB)实验验证miR-146a在信使RNA(messenger RNA,mRNA)和蛋白水平对靶基因存在调控作用。结果1.与人正常肺上皮细胞BEAS-2B相比较,miR-146a在三株人肺腺癌细胞A549、H1299、PC-9中均低表达。2.选取A549细胞作为实验对象,转染miR-146a mimics 6小时后荧光显微镜观察其大致转染效率达90%以上,48小时后通过RT-qPCR实验检测miR-146a过表达倍数达到10000倍以上,miR-146a过表达成功。3.CCK8实验、流式凋亡检测实验、Transwell侵袭实验和划痕实验结果示过表达miR-146a能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡,以及抑制A549细胞的侵袭和迁移能力。4.通过Targetscan、miRDB在线预测分析,miR-146a可与白细胞介素受体相关激酶1(Interleukin receptor associated kinase 1,IRAK1)以及肿瘤坏死因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)的3’-UTR相关序列结合。双荧光素酶报告基因结果显示,同时转染了野生型报告基因载体(IRAK1-WT,TRAF6-WT)和miR-146a mimics组的A549细胞荧光素酶活性比值明显降低,而同时转染了突变型报告基因载体(IRAK1-MUT,TRAF6-MUT)和miR-146a mimics(或者miR-146a nc)组的A549细胞荧光素酶活性比值无明显差异。5.RT-qPCR实验和WB实验结果显示过表达miR-146使A549细胞中靶基因IRAK1、TRAF6在mRNA和蛋白水平表达均降低。结论miR-146a在人肺腺癌细胞中表达明显降低,其应扮演抑癌基因角色。miR-146a显著抑制A549细胞的增殖生长、侵袭迁移,并促进凋亡,其可能是通过抑制靶基因IRAK1、TRAF6的表达实现,有望为肺癌的临床分子治疗提供一个有效新靶点。