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背景随着塑料制品大量的生产和使用,全球化的塑料污染问题日趋严重,塑料生产中广泛使用的增塑剂邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）对人群健康产生的危害备受关注。DEHP是一种类雌激素样物质,具有内分泌干扰作用,生物体暴露于DEHP会引发多种健康损害,生殖系统损伤也是重要的一部分。目前对DEHP在生殖衰老方面的研究还较少,探讨DEHP的致生殖衰老作用及其机制具有重要意义。本研究应用模式生物秀丽线虫初步探讨DEHP诱导雌性生殖衰老及相关机制。目的1.探讨DEHP对秀丽线虫性腺和卵母细胞衰老的影响,以及氧化应激和自噬在生殖衰老中的作用。2.探讨亲代DEHP染毒是否能引起脱毒子代生殖障碍及其跨代效应。方法与结果1.DEHP致秀丽线虫生殖衰老作用以秀丽线虫生殖系统为研究对象,分别设立0.01,0.1,1和10 mg/L染毒组,同时K溶液为对照组。采用体视显微镜观察并记录后代数目、生殖寿命和寿命,采用荧光显微镜观察成虫性腺大小,及观察成虫第一、三、五和第七天卵母细胞的形态变化。1.1 DEHP染毒后对秀丽线虫后代数目和繁殖寿命的影响（1）与对照相比,L1期线虫染毒72 h后,各染毒组后代数目显著下降（P＜0.05）。（2）与对照相比,各染毒组生殖寿命均低于对照组（P＜0.05）。1.2 DEHP染毒对秀丽线虫卵母细胞发育的影响（1）DEHP染毒后,与对照相比,各处理组的性腺面积均低于对照组（P＜0.05）。（2）DEHP染毒后,与对照相比,各处理组成虫第一天的卵母细胞排列出现内吞卵母细胞（Endomitotic oocyte,Emo）表型,此外,10 mg/L组还出现了性腺扭曲。（3）DEHP染毒后,各处理组成虫第三天的除了出现Emo表型外,在0.01mg/L DEHP组的卵母细胞排列出现缺口;在0.1,1和10 mg/L DEHP组出现了蠕虫袋（Bag of Worms,BOW）表型,虫卵在母体内孵化;此外,在1和10 mg/L DEHP组还出现卵母细胞萎缩。（4）DEHP染毒后,对照组成虫第五天观察到Emo表型,在0.01 mg/L DEHP组的出现了BOW表型,在0.1,1和10 mg/L DEHP组不仅出现了BOW表型,还出现卵母细胞萎缩。（5）DEHP染毒后,在对照组成虫第七天观察到萎缩的卵母细胞,在0.01 mg/L组的出现了BOW表型;在各染毒组均出现卵母细胞萎缩。1.3 DEHP染毒对秀丽线虫寿命的影响DEHP染毒后能够显著降低秀丽线虫的平均寿命,在0.1,1和10 mg/L DEHP组秀丽线虫的寿命明显缩短（P＜0.05）。2.DEHP致秀丽线虫生殖衰老的机制采用H2DCF-DA探针测体内活性氧水平,NADPH法测定GPX酶活力变化水平,WST-8法检测SOD酶活力变化水平;荧光显微镜观察秀丽线虫卵母细胞的形态变化,利用报告基因虫株DA2123,MAH235观察虫株中自噬小体和自噬溶酶体的表达情况,利用报告基因虫株SJ4005和SJ4100观察热应激蛋白的表达,及利用报告基因虫株RT130观察卵黄蛋白表达的影响;采用RT-q PCR测定氧化应激相关基因gpx-5,gpx-7,ctl-3,sod-5,自噬相关基因atg-7,atg-18,unc-51,lgg-1,bec-1,卵黄蛋白基因vit-2,热应激相关基因hsp-4,hsp-6,hsp-16.1,hsp-16.2的转录水平。2.1 DEHP对秀丽线虫活性氧表达的影响（1）与对照组相比,DEHP染毒显著增加了秀丽线虫体内的活性氧水平（P＜0.05）。（2）与对照组相比,在0.1,1和10 mg/L DEHP组SOD和GPX酶活性显著降低（P＜0.05）。（3）与对照组相比,sod-5,gpx-5和gpx-7基因表达在0.01,0.1,1和10 mg/L DEHP组显著下降（P＜0.05）,ctl-3基因在0.1,1和10 mg/L DEHP剂量组显著降低（P＜0.05）。2.2 DEHP对秀丽线虫自噬表达的影响（1）与对照组相比,染毒组DA2123接缝细胞自噬小体表达显著增加。（2）与对照相相比,染毒组MAH235线虫体内细胞核定位显著增加。（3）基因atg-7在0.01,0.1,1和10 mg/L DEHP组显著升高（P＜0.05）。基因atg-18,lgg-1在0.1,1和10 mg/L DEHP组显著升高（P＜0.05）。基因bec-1,unc-51,hlh-30,xpo-1仅在0.1和1 mg/L DEHP组显著升高（P＜0.05）,且xpo-1基因在10 mg/L DEHP组显著下降（P＜0.05）。2.3 DEHP对秀丽线虫热应激蛋白表达的影响（1）DEHP能够显著降低HSP-4,HSP-6蛋白的表达量,HSP-4在0.01,0.1,1和10 mg/L DEHP组明显降低（P＜0.05）,HSP-6在0.1,1和10 mg/L DEHP组明显降低（P＜0.05）。（2）与对照相比,hsp-16.1基因在0.01和10 mg/L DEHP组显著降低（P＜0.05）,hsp-16.2在0.01,0.1,1和10 mg/L DEHP组显著降低（P＜0.05）,基因hsp-4,hsp-6在0.1,1和10 mg/L DEHP组显著降低（P＜0.05）,hsp-6基因在0.01 mg/L DEHP组显著升高（P＜0.05）。2.4 DEHP对秀丽线虫卵黄蛋白表达的影响（1）与对照相比,各染毒组显著降低了VIT-2蛋白的表达水平（P＜0.05）。（2）与对照相比,各染毒组显著降低了vit-2基因的表达水平（P＜0.05）。3.DEHP致秀丽线虫跨代生殖损伤利用体视显微镜观察并记录F1-F5的后代数目,显微镜观察F1-F4的卵母细胞形态变化,利用RT-q PCR测定表观遗传基因met-2和spr-5在F0-F5中的转录变化。3.1 DEHP对秀丽线虫多代后代数目的影响DEHP显著降低F1-F3代后代数目,F4和F5的后代数目恢复到对照水平。与对照相比,脱毒后F1代在0.1,1和10 mg/L DEHP组出现后代数目的显著下降（P＜0.05）。然而,F2、F3代仅在10 mg/L DEHP组出现后代数目的显著下降（P＜0.05）。3.2 DEHP对秀丽线虫多代卵母细胞发育的影响F1代成虫第一天卵母细胞观察结果表明,与对照相比,各染毒组出现明显的Emo表型,0.01和0.1 mg/L组性腺还出现扭曲的表型;与对照相比,成虫第三天0.1,1和10 mg/L DEHP组出现明显的卵母细胞萎缩表型,在10 mg/L DEHP组出现BOW表型;成虫第五天、第七天与对照相比,DEHP组出现明显的卵母细胞萎缩和Emo表型。F2代成虫第一天卵母细胞观察结果表明,与对照相比,在0.01和0.1 mg/L DEHP组与对照基本无差异,在1mg/L DEHP组出现少量的Emo表型且卵母细胞排列出现缝隙,在10mg/L DEHP组出现少量的Emo表型,且性腺出现扭曲;成虫第三天与对照相比,在1和10mg/L DEHP组出现明显的卵母细胞萎缩和Emo表型,在1 mg/L DEHP组还出性腺扭曲;成虫第五天、第七天与对照相比,在0.01 mg/L DEHP组出现少量的Emo表型,在1和10 mg/L DEHP组出现明显的卵母细胞萎缩和Emo表型,第七天在10 mg/L DEHP组出现了BOW表型。与对照相比,F3代后代成虫第一天、第三天的卵母细胞中在1和10 mg/L DEHP组出现少量的Emo表型,第五天第七天在1和10 mg/L DEHP组细胞萎缩明显。F4代后代成虫卵母细胞在同一时间与对照相比变化基本无差异。3.3 DEHP对秀丽线虫多代甲基化相关基因表达的影响（1）与对照相比,F0代met-2基因表达水平在0.1,1和10 mg/L DEHP组显著的下降;F1代met-2基因表达水平在0.01和0.1mg/L DEHP组显著的下降,在1mg/L DEHP组显著增加;F2代met-2基因表达水平在0.01和10 mg/L DEHP组显著升高,在1 mg/L DEHP组显著下降;F3代met-2基因表达水平在0.01,0.1,1和10 mg/L出显著下降;F4代met-2基因表达水平在0.01和0.1出现显著下降,在10 mg/L出DEHP组显著升高;F5代met-2基因表达水平在0.01和10 mg/L DEHP组显著的下降（P＜0.05）。（2）与对照相比F0代spr-5基因表达水平在0.01,1和10 mg/L显著下降;F1代spr-5基因基因表达水平在0.01,0.1和10 mg/L DEHP组显著下降,在1 mg/L显著上升;F2代spr-5基因表达水平在0.01,0.1和10 mg/L DEHP组显著上升;F3代spr-5基因表达水平在0.01,0.1,1和10 mg/L DEHP组显著下降;F4代spr-5基因表达水平在0.01 mg/L DEHP组出现显著下降,在10 mg/L DEHP组出现显著上升;F5代spr-5基因表达水平仅在0.01 mg/L DEHP组出现显著下降（P＜0.05）。结论1.DEHP促进秀丽线虫雌性生殖衰老,生殖系统提前出现衰老表型,即Emo和BOW表型,导致后代数目减少,生殖寿命和寿命缩短。2.DEHP可能通过增加秀丽线虫活性氧和自噬的表达,抑制热应激蛋白HSP-4、HSP-6表达和降低卵黄蛋白表达,同时抑制抗氧化酶SOD和GPX酶活性,导致氧化应激失衡,从而促进生殖衰老。3.亲代秀丽线虫DEHP染毒能够引起跨代生殖毒性,损伤可以延续到F3代,F4代逐渐恢复,这可能与基因met-2和spr-5的表观遗传调控有关。