【摘 要】
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沙门氏菌（Salmonella）是一种兼性胞内寄生的食源性致病菌,是世界卫生组织公布的严重威胁人类健康的病原体之一。沙门氏菌的毒力主要由沙门氏菌毒力岛（Salmonella pathogenicity island,SPI）决定,其中沙门氏菌毒力岛1（Salmonella Pathogenicity Island 1,SPI1）可参与沙门氏菌入侵宿主肠上皮细胞和巨噬细胞的过程,沙门氏菌毒力岛2（S
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沙门氏菌（Salmonella）是一种兼性胞内寄生的食源性致病菌,是世界卫生组织公布的严重威胁人类健康的病原体之一。沙门氏菌的毒力主要由沙门氏菌毒力岛（Salmonella pathogenicity island,SPI）决定,其中沙门氏菌毒力岛1（Salmonella Pathogenicity Island 1,SPI1）可参与沙门氏菌入侵宿主肠上皮细胞和巨噬细胞的过程,沙门氏菌毒力岛2（Salmonella Pathogenicity Island 2,SPI2）则负责沙门氏菌在巨噬细胞和肠上皮细胞内的复制。外泌体是体内几乎所有活细胞通过内吞-溶酶体系统释放的一种直径约30 nm～150 nm的胞外囊泡,其内含有来自外泌体本身或来源细胞的蛋白质、脂质、核酸等,通过与受体细胞互作起到胞间信息交流的作用,调节机体免疫应答、炎症等过程。目前,有关外泌体在细菌感染中作用的研究较少且多集中于结核分枝杆菌,因此,对沙门氏菌感染的巨噬细胞外泌体进行研究十分有必要。在本实验室前期构建的肠炎沙门氏菌基因缺失株[G9（Δhil A）、G9（Δhil D）、G9（Δssr AB）、G9（Δssr ABhil A）和G9（Δssr ABhil Ahil D）]、鼠伤寒沙门氏菌基因缺失株[S.T（Δhil D+pc DNA3.1）]基础上,开展如下试验:（1）采用MTT法测定RAW264.7巨噬细胞感染沙门氏菌不同时间段的细胞活力,确定收集细胞上清的最佳时间。（2）按照MOI=50:1（细菌:细胞）感染RAW264.7巨噬细胞后,采用滤膜法和差速离心法提取G9组、G9（Δhil A）组、G9（Δhil D）组、G9（Δssr AB）组、G9（Δssr ABhil A）组、G9（Δssr ABhil Ahil D）组、S.T（pc DNA3.1）组、S.T（Δhil D+pc DNA3.1）组以及空白对照组共计9组巨噬细胞培养上清的外泌体。（3）利用透射电镜、Nanosight纳米颗粒跟踪分析仪和Western blotting方法对外泌体的形态大小、粒径分布及表面蛋白CD9、CD63及TSG101进行鉴定。（4）采用基于数据非依赖性采集（Data independent acquisition,DIA）技术的定量蛋白组学比较9组外泌体蛋白差异,进行生物信息学分析,对同一血清型沙门氏菌中ssr AB、hil A、hil D基因和不同血清型沙门氏菌中hil D基因对巨噬细胞外泌体的影响进行初步探究。结果显示:（1）收集细胞培养上清的最佳时间为沙门氏菌感染巨噬细胞后第24 h。（2）采用滤膜法和差速离心法结合的方法成功提取到了外泌体沉淀。（3）透射电镜下,分离到的外泌体为双层膜的圆形囊泡或典型茶托样结构,大小为30 nm～150 nm;粒径曲线较为流畅,主峰在20 nm～110 nm之间,符合外泌体的预期大小,且9组外泌体粒径曲线趋势一致;Western blotting可见各组外泌体CD9、CD63和TSG101蛋白均有表达。（4）9组样品共定量到10 007个肽段和2 687个蛋白;分析各组外泌体差异蛋白,发现缺失hil A组的共有蛋白主要富集于嘌呤代谢等通路,缺失hil D组的共有蛋白主要富集于Wnt、Fox O信号通路等,缺失ssr AB组的共有蛋白主要富集于药物代谢-其他酶、谷胱甘肽代谢通路等。结果表明:（1）本研究成功提取G9组、G9（Δhil A）组、G9（Δhil D）组、G9（Δssr AB）组、G9（Δssr ABhil A）组、G9（Δssr ABhil Ahil D）组、S.T（pc DNA3.1）组、S.T（Δhil D+pc DNA3.1）组和空白对照组巨噬细胞外泌体,经透射电镜、纳米粒径分析及表面标志蛋白鉴定,均符合外泌体特征。（2）hil A基因在肠炎沙门氏菌中可能通过影响外泌体内与嘌呤代谢通路有关的蛋白调控沙门氏菌中嘌呤的生物合成;hil D基因可能通过影响外泌体内有关Fox O信号通路、Wnt/β-catenin信号通路的蛋白调节细胞凋亡过程,相关蛋白在肠炎沙门氏菌中蛋白下调,而在鼠伤寒沙门氏菌中蛋白上调;ssr AB基因在肠炎沙门氏菌中可能通过影响外泌体内有关药物代谢-其他酶和谷胱甘肽代谢途径相关的蛋白影响巨噬细胞免疫过程及机体炎症反应。
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