目的:颅脑创伤（Traumatic brain injury,TBI）后昏迷是神经外科常见急危重症,具有高致残死率的特点。TBI后昏迷患者能否尽快苏醒是影响临床预后的重要因素,且如何促醒是国内外神经科学界研究的热点和难点。手十二井穴刺络放血（简称井穴放血）是中医传统的急救促醒技术,本团队应用该法治疗中枢神经损伤开展多个临床试验证实井穴放血法可安全、有效改善TBI、中风及一氧化碳中毒患者急性期的意识水平,但其促醒机制尚未阐明,限制了该疗法的临床应用与推广。课题组前期研究基于井穴放血对TBI后昏迷大鼠有效促醒效应,发现该法可上调TBI后昏迷大鼠腹侧中脑导水管周围灰质（ventral Periaqueductal gray,v PAG）的P2RX7神经元表达、P2RX7和多巴胺（Dopamine,DA）神经元的兴奋性;通过脑室内注射拮抗剂发现脑内神经投射受体P2RX7、P2RX3及TRPV1介导手十二井穴放血促醒。本研究围绕v PAG的P2RX7受体及多巴胺神经元向下丘脑投射的多巴胺受体进一步阐释井穴放血促进TBI后昏迷大鼠苏醒的生物学机制。方法:1.复制井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应平台（1）复制重型TBI后昏迷大鼠平台:筛选32只健康成年（8周）雄性（Sprague Dawley,SD）大鼠随机分成假手术组（Sham组）、模型组（TBI组）、TBI+井穴放血组（Hand Acu组）,假手术组+井穴放血组（Sham+Hand Acu组）,样本量每组8只。Sham组仅打开颅窗而不进行撞击;TBI组则是打开颅窗后利用电子控制性脑皮质撞击仪（electricity Controlled cortical impact,e CCI）制备重型TBI大鼠模型。根据I-VI级意识状态分级量表进行评级,把符合V、VI级昏迷意识状态TBI大鼠纳入实验;Sham组和TBI组均不给予井穴放血治疗,Hand Acu组、Sham+Hand Acu组在相应造模成功基础上立即给予手十二井穴放血干预治疗,疗效评价主要指标是实时观察实验大鼠的昏迷时程。（2）引入脑电监测技术初步探索基于脑电监测评价井穴放血改善TBI后昏迷大鼠意识水平的效应:筛选6只健康成年（8周）雄性SD大鼠随机分成TBI组、Hand Acu组,样本量每组3只。造模成功后给予安装脑电监测电极连接到Power Lab生物信号采集系统上进行实时脑电监测。利用Mathlab软件提取Alpha、Beta、Delta、Theta波的相对频带能量,并计算Alpha/Theta波相对频带能量的比值来量化井穴放血促醒效应。2.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导井穴放血促醒的研究前期结果发现井穴放血可提高造模后1 h v PAG部位的P2RX7的表达及其兴奋性。故本实验进一步探讨v PAG核团注射P2RX7拮抗剂后观察井穴放血的促醒效应是否消失,以明确v PAG核团的P2RX7受体是否介导井穴放血促醒。实验动物分为4组（n=6只/组）:TBI+DMSO组、Hand Acu+DMSO组、TBI+P2RX7拮抗剂组、Hand Acu+P2RX7拮抗剂组,所有分组均在v PAG核团注射30min后进行造模,其中,Hand Acu+DMSO组、Hand Acu+P2RX7拮抗剂组在行v PAG核团注射及造模成功的基础上进行井穴放血干预。疗效评价指标为实时观察实验大鼠的昏迷时程和改良神经功能缺损评分（modified Neurological severity scores,m NSS）,评估造模后6h大鼠神经功能缺损情况。3.井穴放血对下丘脑多巴胺受体表达的影响研究实验二明确了v PAG脑区P2RX7受体介导井穴放血促醒。课题组前期研究发现v PAG脑区DA神经元表达P2RX7受体,且井穴放血可提高v PAG脑区DA神经元、P2RX7神经元的兴奋性。既往文献报道v PAG的DA神经元可直接投射到下丘脑外侧区（lateral hypothalamus,LH）的食欲素（orexin,ORX）神经元以维持觉醒,下丘脑乳头结节核脑区（tuberomammillary nucleus,TMN）组胺神经元（Histamine,HA）接受多巴胺调节在调控睡眠觉醒中发挥重要作用。因此,本研究进一步探讨井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核脑区多巴胺受体表达量的影响。采用RT-q PCR技术检测造模及井穴放血干预后1h下丘脑多巴胺受体D1（Dopamine receptor D1,DRD1）、多巴胺受体D2（Dopamine receptor D2,DRD2）、多巴胺受体D3（Dopamine receptor D3,DRD3）的基因含量;采用免疫荧光染色方法,DRD1/DRD2/DRD3+DAPI共染,分别检测下丘脑部位LH及TMN核团多巴胺受体的表达情况。4.井穴放血对下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2神经元兴奋性的调控研究本实验探讨了井穴放血对下丘脑LH及TMN区的DRD2神经元的调控作用。采用Sham组、TBI组、Hand Acu组分组设置,采用多重免疫荧光染色方法检测DRD2+cFos+DAPI共染情况,样本量每组n=4,观察井穴放血干预后下丘脑LH及TMN区DRD2表达情况;同时应用Image J检测LH及TMN区的DRD2神经元的兴奋性。另外,选取Hand Acu组样本进行Orexin+DRD2+DAPI、Orexin+c-Fos+DAPI共染,明确下丘脑LH脑区ORX神经元是否表达DRD2受体及井穴放血是否可激活ORX神经元表达c-Fos蛋白。为进一步明确井穴放血是否可激活ORX神经元,选取Sham组、TBI组、Hand Acu组样本（n=4）进行Orexin+c-Fos+DAPI共染。此外,选取Sham组、TBI组、Hand Acu组样本（n=4）进行组胺神经元免疫组化染色,观察井穴放血疗法对TMN脑组胺神经元的影响。结果:1.井穴放血可缩短重型颅脑创伤后昏迷大鼠的昏迷时间本实验观察井穴放血对TBI大鼠昏迷时程的影响,结果发现:（1）假手术+井穴放血组与假手术组相比,昏迷时程无明显变化,提示井穴放血对水合氯醛所致昏迷无促醒作用。大鼠TBI造模,TBI组的昏迷时程与假手术组相比明显升高,提示TBI大鼠模型复制成功。井穴放血干预后,昏迷时程缩短。以上结果说明井穴放血可促进TBI后昏迷大鼠苏醒。（2）脑电图显示,大鼠在昏迷时期脑电呈慢波、波幅高为特点;清醒时期脑电波频率较昏迷时期快、波幅较昏迷时期低为特点。脑电数据分析显示,TBI造模及井穴放血干预后30-40min,TBI组与井穴放血组脑电Alpha/Theta波相对频带能量的比值变化不明显。TBI组造模后40min开始到100min大鼠Alpha/Theta波相对频带能量的比值持续低平。井穴放血干预后40-100min,Alpha/Theta波相对频带能量比值均较TBI组高（升高8.73～19.47%）。以上结果提示井穴放血可一定程度改善TBI后昏迷大鼠的意识。2.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导井穴放血促醒TBI组与TBI+P2RX7拮抗剂组相比,昏迷时程无明显变化,提示P2RX7拮抗剂对TBI大鼠昏迷时程无明显影响。井穴放血组与TBI组相比,井穴放血干预后可明显缩短TBI大鼠昏迷时间且有统计学意义;其与TBI+P2RX7拮抗剂组相比,也可明显缩短TBI大鼠昏迷时间且有统计学意义。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与井穴放血组相比,大鼠昏迷时程升高有统计学意义;井穴放血+P2RX7拮抗剂组与TBI组及TBI+P2RX7拮抗剂组相比,昏迷时间均无统计学意义。在m NSS评分方面:井穴放血组与TBI组及TBI+P2RX7拮抗剂组相比,6h m NSS评分得到改善。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与井穴放血组相比,m NSS评分有一定升高,但无统计学差异。井穴放血+P2RX7拮抗剂组与TBI组、TBI+P2RX7拮抗剂组相比,m NSS评分有一定下降,但无统计学差异。以上实验结果提示,v PAG的P2RX7受体信号通路可能介导井穴放血的促醒效应。3.井穴放血可提高下丘脑LH及TMN脑区DRD2的表达量下丘脑多巴胺受体基因含量检测结果显示,井穴放血干预后1h下丘脑DRD1、DRD2、DRD3基因含量均明显升高且有统计学意义。免疫荧光染色结果显示,井穴放血干预后1h在下丘脑LH及TMN区DRD2有大量表达,DRD1、DRD3无表达。荧光定量结果显示,在下丘脑LH区,与假手术组相比,造模后TBI组DRD2下降有统计学意义;井穴放血组与TBI组相比,井穴放血干预后DRD2升高有统计学意义;井穴放血组与假手术组相比,DRD2升高有统计学意义。在TMN区,TBI组与假手术组相比,造模后DRD2下降不明显;井穴放血干预后,与TBI组相比,井穴放血组DRD2升高有统计学意义;井穴放血组与假手术组相比,DRD2升高29.36%,但无统计学差异。实验结果表明,井穴放血可上调下丘脑LH及TMN脑区DRD2的表达量。4.井穴放血可提高下丘脑LH及TMN区DRD2神经元兴奋性下丘脑LH及TMN区多重免疫荧光染色结果分析显示:井穴放血干预后,TBI后昏迷大鼠下丘脑LH及TMN区DRD2神经元兴奋性明显升高且有统计学意义。共染结果发现LH区ORX神经元表达DRD2,井穴放血使LH区ORX神经元与c-Fos共染率达81.6%的（0.816±0.020）;且井穴放血可显著上调下丘脑LH区ORX神经元的表达量。下丘脑TMN的组胺组化结果显示,与假手术组比,TBI组造模后1h下丘脑TMN区组胺神经元表达增多;与TBI组比,井穴放血干预后,可显著下调1h下丘脑TMN区组胺神经元的表达量。以上实验结果表明井穴放血可增加下丘脑LH及TMN核团DRD2神经元兴奋性;LH核团食欲素神经元表达DRD2,井穴放血可上调LH核团ORX神经元表达,并兴奋ORX神经元;井穴放血可下调放血干预后1h下丘脑TMN区组胺神经元表达。结论:1.腹侧中脑导水管周围灰质P2RX7受体介导手十二井穴放血促醒作用。2.手十二井穴放血可增加下丘脑外侧区及乳头结节核区多巴胺受体D2表达及其神经元兴奋性,可能是井穴放血促醒的作用环节之一。3.井穴放血可上调下丘脑外侧区食欲素神经元数量,抑制下丘脑乳头结节核区组胺神经元数量;但其介导井穴放血促醒机制尚需进一步验证。