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草地早熟禾(Poa Pratensis L.)属冷季型草坪草,是温带地区重要的草坪草种之一,具有兼性无融合生殖特性。它具有色美、耐荫、耐修剪、耐践踏等优点,常用于草坪和绿地的建植,但它也具有一些自身的缺点,如易受病虫危害、不耐炎热、耐高低温能力差、抗旱力不强等。由于草地早熟禾兼性无融合生殖特性,利用常规的育种方法培育新品种受到了很大的限制。植物细胞工程和基因工程技术的发展为提高草地早熟禾的抗逆性提供了一条新途径。本试验以3个草地早熟禾品种(午夜2号、新格莱德和橄榄球2号)为材料,建立草地早熟禾愈伤组织再生系统,以此为基础建立草地早熟禾原生质体培养及不同品种间原生质体融合等研究。1.以草地早熟禾品种午夜2号、新格莱德和橄榄球2号成熟种子为外植体,进行了植株再生的研究。结果表明:(1)午夜2号诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+1mg/L 2,4-D +0.1mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,其诱导率为52.3%;最佳继代培养基为:MS+1mg/L 2,4-D+0.3mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7琼脂;最佳分化培养基为:MS+0.5mg/L NAA+1mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%琼脂,分化率为57.5%。(2)新格莱德诱导愈伤组织的最佳培养基为MB5+3mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,其诱导率为75%;最佳继代培养基为:MS+3mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂;最佳分化培养基为:MS+0.5mg/L NAA+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%琼脂,分化率为55%。(3)橄榄球2号诱导愈伤组织的最佳培养基和最佳继代培养基为MS+3mg/L 2,4-D +0.1mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.7%琼脂,其诱导率为80.5%;最佳分化培养基为:MS+0.5mg/L NAA+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.6%琼脂,分化率为52.5%。2.以草地早熟禾品种午夜2号、新格莱德和橄榄球2号成熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,以酶解法分离出原生质体,进行了原生质体培养和植株再生。研究了不同酶液组成、酶解时间、愈伤组织继代时间和渗透压对草地早熟禾原生质体游离及植株再生的影响。结果表明:(1)采用继代培养8～10d的胚性愈伤组织在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,酶解14～16h可得到产量和活力较高的原生质体。(2)原生质体在KM8P培养基中培养3d后出现第一次细胞分裂,2～3周后形成小细胞团,此时添换0.1mol/L～0.2mol/L甘露醇渗培养基2～3次,有利于小细胞团持续分裂并形成愈伤组织。(3)成功地获得了草地早熟禾品种午夜2号和新格莱德原生质体再生植株以及橄榄球2号原生质体来源的愈伤组织。3.利用PEG融合法对午夜2号和新格莱德的原生质体进行了融合,获得了体细胞杂种愈伤组织。研究了预处理对亲本原生质体活力的影响和适宜的融合条件,结果表明:(1)用不同浓度的碘乙酰胺(IOA)处理新格莱德原生质体,得到以下结果:以5mmol/mL IOA处理10min,能有效地使新格莱德原生质体失活。(2)用不同浓度的罗丹明处理午夜2号原生质体,得到以下结果:以40μg/mL处理5min,能有效地使午夜2号原生质体失活。(3)通过PEG诱导原生质体融合,得到草地早熟禾种间体细胞杂种,最佳融合条件为:PEG(6000)浓度为35%,融合率为9.8%。