基于LC-MS技术的鞘脂组学和代谢组学分析方法的建立及应用

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内源性代谢物广泛参与生命体内的重要活动,与人类健康和多种疾病的发生、发展密切相关。因此,针对代谢物建立高效、稳定的检测手段,不仅对相关技术的发展具有推动作用,而且有助于在分子层面上实现对复杂生命活动规律的深入认识。本研究建立了基于液质联用(LC-MS)技术的鞘脂组学和代谢组学的分析方法,并分别用于2型糖尿病鞘脂生物标志物的筛查以及中药扶正化瘀方对大鼠肝纤维化的干预研究。本论文的主要内容如下:  1、人血清鞘脂组学分析方法的建立及验证  在经典提取方法的基础上,优化筛选出一种高效、稳定的鞘脂提取方法。该方法可以保证人血清中包括单唾液酸二己糖神经节苷脂(GM3)在内的多种鞘脂的整体提取效率,同时可有效去除甘油磷脂类等基质干扰。采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(UHPLC-QTOF-MS)技术,鉴定了人血清中8类共146个鞘脂化合物,其中包括30个GM3。此外,对该方法进行了检测灵敏度、线性范围、回收率、重现性和稳定性等考察。结果表明此方法稳定、可靠,适合于体内不同种类鞘脂的同时定量分析。  2、鞘脂组学分析方法用于2型糖尿病鞘脂生物标志物的筛查  采用所建立的鞘脂组学分析方法,对20例2型糖尿病患者和20例健康志愿者的血清样本进行比较分析。通过主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法,并结合常规统计分析,筛选出39个与2型糖尿病相关的鞘脂标志物,其中10个对其诊断具有较高的准确性。此外,对这些潜在标志物的代谢途径与胰岛素抵抗的关联进行了初步探索,推断鞘脂含量变化会导致体内相关细胞信号的紊乱,从而引发胰岛素抵抗和2型糖尿病发生。  3、代谢组学分析方法用于扶正化瘀方抗大鼠肝纤维化的疗效评价  将大鼠随机分成正常对照组、二甲基亚硝胺(DMN)诱导肝纤维化模型组及扶正化瘀方给药组,采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(UHPLC-TOF-MS)技术对大鼠血清中内源性代谢物进行全谱检测,所得数据采用PLS-DA方法进行模式识别分析。结果显示,正常组和模型组大鼠的血清代谢轮廓存在显著差异,而给药组则在空间投影上呈现出“偏离模型组且接近正常组”的趋势。此外,根据变量重要性投影值(VIP)筛选出19种相关的代谢标志物。该研究验证了扶正化瘀方抗大鼠肝纤维化的疗效,其潜在作用机制可能与修复体内异常的脂质和氨基酸代谢有关。
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