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性别直接关系着物种延续。脊椎动物性别决定主要存在两种方式:基因型性别决定(genotypic sex determination，GSD)和环境依赖型性别决定(environmental dependent sex determination，ESD)。GSD物种具有性染色体，且性染色体上的基因对性别决定具有关键作用。环境依赖型性别决定则受环境因子的影响，其中最常见的形式是温度依赖型性别决定(temperature-dependent sex determination，TSD)。在爬行类中，TSD尤为常见，所有的鳄目，许多龟类及部分蜥蜴都属于TSD。尽管，爬行类中TSD的现象十分普遍，但是温度是如何影响性别决定相关的基因并决定性别，至今仍不清楚。乌龟(Mauremys reevesii)广泛分布于中国大陆，是典型的TSDⅠa型（低温雄性、高温雌性）物种。本研究旨在探讨乌龟温度依赖型性别决定的分子机制。 首先，通过RACE克隆了乌龟性别决定相关的部分基因，获得以下基因的编码序列。Cyp19a1(GenBank accession:KU821113)长1995bp，包含一段编码504个氨基酸的编码区;Foxl2(GenBank accession:KU821114)长2224bp，含有一段编码301个氨基酸的编码区;Rspo1(GenBank accession:KU821115)长1633bp，含有一段编码260个氨基酸的编码区;Sf1(GenBank accession:KU821116)全长为1812bp，含有一段编码466个氨基酸的编码区，以及Sox9(GenBank accession:KU821117)全长为2053bp，含有一段编码491个氨基酸的编码区。这些序列为研究TSD与GSD之间的进化提供基础。 其次，探究了性别决定相关基因Cyp19a1，Foxl2，Rspo1，Sf1，Sox9以及Dmrt1在不同孵化温度下的表达模式。结果显示，Cyp19a1，Foxl2及Rspo1为雌性特异性表达，Sf1与Dmrt1为雄性特异性表达。Foxl2与Rspo1在温度敏感期早期时，雌性孵化温度下(female producing temperature，FPT)的表达量就显著高于雄性孵化温度下(male producing temperature，MPT)的表达量，这意味Foxl2与Rspo1在温度依赖型性别决定通路中处于上游位置。Dmrt1在温度敏感期早期时，MPT孵化的胚胎表达量就显著高于FPT中胚胎的表达量，表明Dmrt1是TSD雄性性别决定中的关键因子之一。Sox9直至温度敏感期的末期才出现雄性特异性表达，可见Sox9更倾向于参与性别分化而非性别决定。Sf1在整个温度敏感期内虽然表现出雄性特异性表达，但是在中期时表达量在MPT与FPT之间并没有显著差异。 此外，TSD物种中，编码芳香化酶的基因Aromatase/Cyp19a1对雌性性别决定通路可能具有上调作用。另一方面，在GSD物种中，Foxl2已被证实能够直接上调Cyp19a1表达。因此，我们假设:(1)Foxl2与Cyp19a1之间可能存在正反馈;(2)温度可能影响芳香化酶aromatase的活性，作用于上述正反馈通路，上调雌性性别决定通路，导致雌性分化。为了验证该假设，本研究在26℃恒温孵化的乌龟卵内分别过表达含有Foxl2编码序列的表达质粒。结果显示Foxl2过表达导致Cyp19a1表达量明显上调，表明Foxl2能够上调Cyp19a1的表达，同时Rspo1的表达量也被上调，Sf1与Sox9的表达量也略有上调。而参与雄性性别决定的Dmrt1表达量受到抑制。同时，Cyp19a1过表达，雌性相关基因Foxl2及Rspo1的表达量显著上升，Sf1与Sox9的表达量也被上调，而Dmrt1的表达量受到抑制。此外，在MPT下过表达Foxl2和Cyp19a1的胚胎出现了卵巢与卵睾体的结构。 最后，通过染色体步移扩增了Foxl2与Cyp19a1的启动子序列并预测了转录因子结合位点，结果显示，在Cyp19a1的启动子上存在FOX与Sf1的结合位点，进一步表明TSD中Foxl2能直接上调Cyp19a1。由于芳香化酶aromatase的活性受到温度影响，且Cyp19a1能够正反馈调节Foxl2。因此，Foxl2与Cyp19a1之间的正反馈调节是TSD爬行动物雌性性别决定的一个关键因素。