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糖尿病患者接受口腔种植术后比正常缺失牙患者的高失败率越来越被受到口腔种植方面研究的重视。糖尿病是一种常见的内分泌疾病,血糖高是糖尿病的主要症状。有学者发现糖尿病可以造成骨代谢异常,成骨质量不佳。而成骨质量与口腔种植的成功与否有着密切的联系。骨髓间充质干细胞(BMSCs)在骨代谢方面发挥着巨大的作用。已有研究证实在高糖环境下BMSCs的生理功能受到影响从而影响到成骨的质量[2]。糖原合成激酶3β (GSK3β)是生物学功能多样的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,GSK3β是糖代谢的重要调控蛋白,在葡萄糖水平的调节以及糖尿病相关指标的改变上发挥着重要的作用。GSK3β可以调控β-Catenin的磷酸化及稳定,而Cyclin D1是β-catenin/LEF-1通路下游的靶基因,同时也是一个与细胞增殖密切相关的因子。而也有研究证实抑制GSK3β可以通过上调CXCR-4的表达来促进间充质干细胞的迁移能力。因此GSK3β是一个与Cyclin D1以及CXCR-4关系密切的因子。干细胞微环境是指影响干细胞增殖分化等生理功能的一切因素。本实验采用高糖微环境诱导大鼠来源的BMSCs,观察高糖微环境条件下的BMSCs细胞增殖及定向迁移能力,同时结合GSK3β、Cyclin D1以及CXCR-4进一步探讨高糖微环境调控BMSCs增殖以及定向迁移能力的机理。为糖尿病影响口腔种植成功率提供基础依据。第一部分大鼠BMSCs的提取、鉴定及生物学功能检测目的：从SD大鼠提取BMSCs并对其表面分子标志物进行鉴定,检测其增殖、克隆形成能力以及成脂成骨分化能力。方法：从3周龄SD大鼠提取BMSCs,体外传代培养。利用流式细胞仪对干细胞表面分子标志物进行检测,采用噻唑蓝(MTT)法检测其增殖能力,采用克隆形成买验检测细胞的克隆形成能力,并对细胞进行成脂成骨诱导及染色,检测细胞的多项分化能力。结果：提取的BMSCs呈纺锤形,流式细胞仪检测表面标志物：CD90、CD105阳性,CD34、CD45呈阴性,生长第3天进入对数增长期,第6天进入平台期,具有克隆形成能力和成骨及成脂的多项分化潜能。结论：成功提取出SD大鼠的BMSCs,细胞符合干细胞的表面CD表型,具有增殖的潜能以及克隆形成的能力,具有多项分化潜能。第二部分高糖微环境通过抑制Cyclin D1影响BMSCs的增殖目的：结合Cyclin D1探讨高糖微环境对于BMSCs增殖的影响方法：采用噻唑蓝(MTT)法检测不同糖浓度下(5.5mM,16.5mM) BMSCs的增殖能力,利用流式细胞仪检测高糖微环境对BMSCs细胞周期的影响。采用RT-PCR技术检测高糖微环境对Cyclin D1表达的影响。Western Blots检测高糖微环境对Cyclin D1及CDK4表达的影响。结果：噻唑蓝(MTT)法检测结果显示高糖微环境可以抑制BMSCs的增殖,同时细胞周期结果显示高糖微环境可以抑制细胞从G1期向S期过度。RT-PCR及Western blots结果显示高糖微环境可以抑制细胞Cyclin D1及CDK4的表达。结论：高糖微环境可以通过抑制BMSCs中Cyclin D1的表达影响细胞的增殖能力。第三部分高糖微环境通过抑制CXCR-4影响BMSCs的定向迁移目的：结合CXCR-4探讨高糖微环境对于BMSCs定向迁移能力的影响。方法：采用Transwell技术检测不同糖浓度下(5.5mM,16.5mM) SDF-1以及CXCR-4抑制剂AMD3100对BMSCs定向迁移能力的影响。利用RT-PCR以及Western Blots检测高糖微环境对细胞CXCR-4表达的影响。结果：在不同糖浓度下SDF-1均可以促进BMSCs的定向迁移,AMD3100可以抑制SDF-1的促进作用。高糖微环境可以抑制BMSCs在SDF-1条件下的定向迁移能力。RT-PCR及Western blots结果显示高糖微环境可以抑制CXCR-4的表达。结论：高糖微环境可以通过抑制CXCR-4的表达影响SDF-1/CXCR-4生物轴调控BMSCs的定向迁移能力。第四部分高糖微环境通过GSK3β调控BMSCs的增殖及定向迁移目的：结合GSK3β、CyclinD1、CXCR-4探讨高糖微环境对于BMSCs增殖以及定向迁移能力的影响。方法：利用Western Blots检测高糖微环境以及LiCl对不同糖浓度下GSK3β、 β-Catenin表达的影响。利用RT-PCR检测高糖微环境以及LiCl对不同糖浓度下LEF-1、CyclinD1、CXCR-4表达的影响。利用MTT检测LiCl对不同糖浓度下BMSCs增殖能力的影响,利用细胞周期检测LiCl对不同糖浓度下BMSCs细胞周期的影响,利用Transwell检测LiCl对不同糖浓度下BMSCs在SDF-1诱导状态下的定向迁移能力的影响。结果：高糖微环境可以促进GSK3β的表达抑制β-Catenin、LEF-1及下游因子Cyclin D1的表达,抑制GSK3β可以促进β-Catenin、LEF-1及Cyclin D1的表达。高糖微环境可以抑制CXCR-4的表达,抑制GSK3β后可以促进CXCR-4的表达。高糖微环境可以抑制BMSCs的增殖及定向迁移的能力,抑制GSK3β可以促进BMSCs的增殖及定向迁移能力。对于细胞周期高糖微环境可以抑制细胞从G1期向S期过渡,而抑制GSK3β可以促进细胞从G1期向S期过渡。结论：高糖微环境可以通过激活GSK3β抑制Cyclin D1、CXCR-4的表达影响BMSCs的增殖定向迁移能力。