论文部分内容阅读
目的:近年来,自然流产（spontaneous abortion）在临床上的发生率明显升高,且有逐年递增趋势。自然流产的病因十分复杂,包括遗传、解剖、内分泌、环境、感染、免疫等等因素。近年来,随着发病率的逐渐增加,对自然流产的发病机制以及临床早期筛查分子标志物的研究显得尤为迫切。基因组学、转录组学、蛋白质组学、脂质组学等各种先进的组学技术的快速发展与应用,也为各类疾病的致病机制和诊疗分子标志物的研究带来了新的契机。材料与方法:建立辅助生殖孕妇队列,在孕5周和孕7周采集孕妇外周血,然后随访至胎儿出生,根据是否发生流产和胎儿是否正常分为流产病例组和健康对照组,分析孕早期流产孕妇血清中蛋白质、脂质的变化规律,用于早期诊断分子标志物筛选和验证;采用UPLC-Orbitrap质谱系统,利用非靶向脂质组学分析平台,并结合Lipid Search软件,对自然流产孕妇血清样本中的脂质进行鉴定与比较分析。采用支持向量机模型、高斯贝叶斯模型（GB）、决策树模型、神经网络模型和K-nearest neighbor模型作为分类器,利用MGRFE、Lasso回归、决策树和RFE选择特征的方法,对差异脂质进行筛选和分析。采用同位素标记相对和绝对定量（i TRAQ）蛋白质组学技术,结合生物信息学分析,筛选自然流产孕妇血清中差异表达蛋白质,采用ELISA和Western blot方法对蛋白质组学的结果进行验证。应用受试者工作特征曲线（ROC）评价血清中差异蛋白质诊断流产的敏感性和特异性。进一步采用生物化学和分子生物学的实验手段研究了差异表达蛋白POF1B在自然流产发生机制中的作用。采用免疫组织化学、q PCR、Western blot等检测自然流产孕妇的绒毛组织中POF1B的表达情况。通过体外培养人绒毛滋养层细胞系HTR-8/Svneo细胞并转染POF1B质粒,构建过表达POF1B的细胞系,并通过细胞凋亡检测试剂盒、CCK-8实验等,检测过表达POF1B对HTR-8/Svneo细胞增殖、凋亡的影响。同时收集过表达POF1B的HTR-8/Svneo细胞,采用Illumina/Solexa测序法进行全转录组学和生物信息学分析,筛选POF1B下游靶基因。利用q PCR和Western blot实验对筛选的下游靶基因进行验证,并采用染色质免疫沉淀（Ch IP）技术和RNA稳定性检测方法对下游靶基因的分子调控机制进行研究。结果:本次研究队列共纳入1008名孕妇,发现自然流产233例。多因素Logistic回归分析结果显示年龄、BMI、吸烟、装修、子宫肌瘤、子宫畸形、甲状腺疾病、自然流产史是自然流产的危险因素（P＜0.05）。在孕妇血清中鉴定到的脂质化合物共有1346个,分属31个种类。5倍交叉验证的支持向量机模型、高斯贝叶斯模型（GB）、决策树模型、神经网络模型和K-nearest neighbor模型分类器中,GB分类器的稳定性和准确性最好,在接下来的特征选择过程中,将其作为分类模型。比较MGRFE、Lasso回归、决策树和RFE选择特征的差异,受试者工作特征（ROC）曲线计算准确度和AUC值进行分层交叉验证,结果显示MGRFE的平均AUC值在四种方法中最高,具有更高的准确性和稳定性。通过这些机器学习策略,在自然流产孕妇血清中筛选到的自然流产脂质标志物为7个差异的脂质分子,包括SM（d39:1）,SM（d41:2）,SM（d18:1/24:2）,DG（18:0/18:0）,DG（22:4/18:2）,PC（40:7）和LPE（18:1）,分属于鞘脂类、甘油脂类、甘油磷脂类和卵磷脂4类。流产孕妇血清SMs水平明显升高,而血清PC和LPE水平显著下降。与对照组相比,流产组含2个饱和脂肪酸链的DG减少,含2个不饱和脂肪酸链的DG增加。通过i TRAQ蛋白质组学分析鉴定出33种在自然流产孕妇和对照孕妇的血清中表达有显著性差异的蛋白质（12个表达上调,21个表达下调）。基因本体论富集（GO）分析结果显示自然流产组在生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）等方面均存在显著性差异。对差异表达蛋白质进行互作用网络分析,有12种具有相互作用。采用Western blot和ELISA实验进行验证,发现POF1B在自然流产组孕妇的血清中的含量显著升高,PSG9和PSG11在自然流产组孕妇的血清中的含量显著减少,ROC曲线分析提示POF1B、PSG9和PSG11可作为自然流产早期诊断的分子标志物。对自然流产诊断效能最好的分子标志物POF1B进行了深入机制研究。细胞学实验结果表明POF1b通过调节JDP2的m RNA稳定性,影响其下游JDP2的含量,增多的JDP2通过转录调控其下游SPP1的表达量,进而增加细胞凋亡,参与流产发生。结论:年龄、BMI、吸烟、装修、子宫肌瘤、子宫畸形、甲状腺疾病、自然流产史是自然流产的危险因素;SM（d39:1）,SM（d41:2）,SM（d18:1/24:2）,DG（18:0/18:0）,DG（22:4/18:2）,PC（40:7）和LPE（18:1）可作为自然流产早期诊断的脂质标志物;POF1B、PSG9和PSG11可作为自然流产早期诊断的蛋白质标志物;POF1B/JDP2/SPP1通路参与细胞凋亡,参与自然流产的发生。