论文部分内容阅读
细胞因子是由活化的免疫细胞和相关细胞（成纤维细胞和内皮细胞等）产生的具有调节细胞功能的生物活性物质。鸡的白细胞介素-1和白细胞介素-6是由单核-巨噬细胞、T淋巴细胞所分泌的某些非特异性发挥免疫调节以及在炎症反应中起作用的细胞因子。目前的研究表明,在一些疾病的发生过程中,鸡白细胞介素-1（ChIL-1）和白细胞介素-6（ChIL-6）的水平发生明显的变化,例如在鸡金黄色葡萄球菌感染后发生的关节炎中,血清中ChIL-6的表达水平异常升高,目前国内外已经把检测人和小鼠血清中IL-6的活性作为评价人和小鼠葡萄球菌关节炎严重性和对疾病抵抗力的重要指标,但是对鸡的研究较少。因此,建立鸡白细胞介素-1和白细胞介素-6的检测方法,对于一些禽病的发病机制的研究和辅助性诊断有着非常重要的意义。本课题将通过分子生物学的方法克隆和表达鸡的白细胞介素-1和白细胞介素-6,并制备相应的抗体建立双抗夹心ELISA检测方法,主要完成以下研究工作:1鸡白细胞介素-1和白细胞介素-6基因的克隆表达根据GenBank中收录的ChIL-1和ChIL-6基因序列分别设计合成了两对特异性的引物,然后提取鸡脾脏细胞的总RNA,利用RT-PCR方法扩增到ChIL-1和ChIL-6基因并克隆到pMD18-T载体上,对所得到的重组质粒进行酶切鉴定及序列测定,BLAST比对结果表明:ChIL-1基因与GenBank上所报道的ChIL-1基因序列（NM 204524）的同源性是98%。ChIL-6基因与GenBank上发表的ChIL-6基因序列（NM 204628）的同源性为99%。分别构建了ChIL-1和ChIL-6基因的原核表达质粒（pET-28a-ChIL-1和PGEX-KG-ChIL-6）,并在E.coli BL21（DE3）中成功获得了表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,分别出现了分子量大小为26KDa和49KDa的蛋白条带,与预期融合蛋白的分子量大小一致。而且Western-blotting分析表明表达产物具有良好的生物学活性,为今后的研究奠定了坚实的基础。2抗鸡白细胞介素-1和白细胞介素-6多克隆抗体的制备与纯化将纯化的重组蛋白作为免疫原,通过设计好的免疫程序,成功制备了兔抗和鼠抗重组蛋白的高免血清,兔抗ChIL-1和ChIL-6抗体效价分别为:1:51200和1:102400;鼠抗ChIL-1和ChIL-6抗体效价分别为:1:102400和1:102400。对所得高免血清分别采用饱和硫酸铵粗提和Sephadex G-200过柱纯化,最后得到了纯化的抗体。3鸡白细胞介素-1和白细胞介素-6的双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用将纯化的鼠抗ChIL-1抗体和鼠抗ChIL-6抗体作为捕获抗体,用兔抗ChIL-1和兔抗ChIL-6多克隆抗体作为检测抗体,建立了检测ChIL-1和ChIL-6的双抗夹心ELISA法,结果表明:ChIL-1的双抗夹心ELISA检测方法的最佳包被浓度为20μg/mL、兔抗ChIL-1抗体（Ab2）的最佳稀释度为1:1600（浓度为10μg/mL）。ChIL-6的双抗夹心ELISA检测方法的最佳包被浓度为50μg/mL、兔抗ChIL-6抗体（Ab2）的最佳稀释度为1:800（浓度为18.5μg/mL）。该方法具有特异性和敏感性。研究结果为开发和研制检测ChIL-1和ChIL-6的双抗夹心ELISA试剂盒奠定了基础。