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穗枯病、白叶枯病、条斑病和基腐病是重要的水稻细菌性病害。准确灵敏地鉴别病原细菌是检疫和防控这些病害的重要手段。本研究通过细菌全基因组序列（WGS）分析,筛选检验已发表和新设计的针对病原细菌的特异引物,建立了准确灵敏检测这些病原细菌的实时荧光定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）方法。水稻细菌性穗枯病的主要病原菌是颖壳伯克氏菌（Burkholderia glumae）。唐菖蒲伯克氏菌(Burkholderia gladioli也能导致水稻穗枯病。基于WGS的系统发育分析显示Burkholderia gladioli有5个系统发育群。引物BG1-F/BG1-R是针对Burkholderia glumae的1个Rhs家族蛋白编码基因的3’端序列设计的特异引物,能特异识别Burkholderia glumae和Burkholderia gladioli中的 2 个系统发育群,能仅从Burkholderia glumae 和 Burkholderia gladioli 扩增出138-bp 片段。用引物BG1-F/BG1-R建立了检测这两种病原菌的EvaGreen dPCR方法。EvaGreen dPCR对两种穗枯病菌检测的灵敏度相同:对菌悬液中检测穗枯病菌的下限为2.0×103菌落形成单位（CFU）/mL,对带菌种子检测下限为200 CFU/粒种子。稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae,Xo）有5个系统发育群:水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）亚洲系（XooAsia）、Xoo非洲系（XooAfrica）、Xo 美国系（XoUS）、水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc）和李氏禾变种（Xanthomonas oryzae pv.leersiae,Xol）。XoUS 形成1个不同于另4个系统发育群的亚种。XooAsia与XooAfrica在基因组相似度（DDH值78.6～79.8%）上的差异已相当于亚种（DDH临界值79～80%）之间的差异,Xoc与XooAsia和XooAfrica在基因组相似度上的差异比亚种之间的差异稍高。针对Xoo和Xoc各自特有基因的序列没有筛选出特异引物。Xo各系统发育群的基因组中存在高水平的假基因（10～15.6%）。铁-红酵母酸/铁-粪生素受体基因fhuE基因序列在Xoc和Xoo基因组中假基因化,有不同程度的缺失。针对在Xoc fhuE假基因中保留而在Xoo fhuE假基因中缺失的区域设计筛选出Xoc特异引物XocFhuE-F/XocFhuE-R,能仅从Xoc中扩增出159-bp片段,依此建立了检测Xoc的SYBR Green qPCR和EvaGreen dPCR方法。qPCR从菌悬液中检测 Xoc 的下限为 1.6×104CFU/mL,dPCR 是 1.6×103CFU/mL。qPCR从带菌水稻种子中检测Xoc的下限是1.2×103 CFU/粒种子,dPCR是120 CFU/粒种子。从Xoo基因组中发现8个Xoo有而Xoc没有的假基因,其中3个假基因对应的真基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、CDP-醇磷脂酰转移酶和传感器激酶。针对这3个假基因序列设计并筛选出XooAsia特异引物XooTPP 1F/XooTPP 1R（扩增片段121 bp）和XooTPP4F/XooTPP4R（扩增片段179 bp）,Xoo特异引物XooCDP1F/XooCDP1R（扩增片段101 bp）、XooSHK1F/XooSHK1R（扩增片段153 bp）和 XooSHK2F/XooSHK2R（扩增片段 138 bp）。用 Xoc 特异引物XocFhuE-F/XocFhuE-R、XooAsia 特异引物 XooTPP4F/XooTPP4R 和 Xoo 特异引物 XooCDP1F/XooCDP1R 建立 了鉴别 Xoc、XooAsia 和 XooAfrica 的多重 PCR法。引物 XooTPP4F/XooTPP4R 和 XooSHK2F/XooSHK2R 不产生引物二聚体,适用于qPCR检测,依此建立了 SYBR Green qPCR法检测XooAsia和Xoo,qPCR从菌悬液中检测XooAsia和Xoo的下限均为1.5×104CFU/mL,从带菌种子中检测XooAsia和Xoo的下限均为2.0×103 CFU/粒种子。基于WGS的系统分类发现Dickeya oryzae可分成4个亚种,水稻基腐病菌属于其中的两个亚种。泛基因组学分析发现Dickeya属中仅Dickeyaoryzae有的7个基因,其中仅水稻基腐病菌有羧酸酯酶（Carboxylesterase,CES）（WP029456382.1）编码基因。针对CES基因序列设计筛选出水稻基腐病菌特异引物DoCES-1F/DoCES-1R,能仅从水稻基腐病菌扩增出128-bp片段,依此建立了检测水稻基腐病菌的SYBR Green qPCR方法,对菌悬液中检测基腐病菌的下限为1.8×104 CFU/mL,对带菌种子的检测下限为1.4×103 CFU/粒种子。总之,本研究将引物BG1-F/BG1-R的特异性扩展到Burkholderia gladioli,首次建立了检测水稻穗枯病菌的dPCR方法;首次基于Xoc和Xoo各自特有的假基因或假基因中的差别区域,设计筛选出Xoc、Xoo及XooAsia特异引物,建立 了鉴别 Xoc、XooAsia 和 XooAfrica 的多重 PCR 法,检测 Xoc、Xoo 和 XooAsia的qPCR方法及检测Xoc的dPCR方法;首次设计了水稻基腐病菌的特异引物,建立了检测水稻基腐病菌的qPCR方法。