稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）引起的水稻白叶枯病害是水稻最重要的细菌性病害,威胁着水稻安全生产。噬菌体作为细菌在自然界的天敌,能够高效地裂解宿主细菌,这为水稻白叶枯病的绿色防控提供了新途径。目前噬菌体的溶菌机制多认为与其裂解系统紧密相关,主要依靠内溶素和穿孔素这两个关键蛋白来完成对细菌的裂解,但不同噬菌体的裂解机制也存在差异,例如大部分噬菌体的内溶素转运输出需依赖穿孔素,但在某些情况下,内溶素也可依靠自身的跨膜结构独立完成转运输出,这些现象揭示了噬菌体裂解机制的多样性和复杂性。虽然近年来越来越多的白叶枯病菌噬菌体被分离和特征化,但整体上对其裂解系统及其机制仍缺乏足够了解。本论文在实验室前期成功分离并鉴定水稻白叶枯病菌OP2家族噬菌体X2的基础上,开展了“穿孔素-内溶素”裂解系统的鉴定及其作用机制研究,取得了以下主要结果:首先,我们成功鉴定和特征化了水稻白叶枯病菌OP2家族噬菌体X2的“穿孔素-内溶素”裂解系统。在前期测定噬菌体X2基因组的基础上,生物信息学分析发现噬菌体X2存在编码裂解相关蛋白X2-Lys（内溶素）和X2-Hol（穿孔素）的序列,X2-Lys的保守功能域分析显示其属于类内溶素蛋白的超家族成员,蛋白跨膜结构和信号肽预测显示该蛋白不存在跨膜结构域和信号肽,暗示其需要穿孔素的帮助以分泌到细胞周质;X2-Hol的跨膜结构域预测结果显示其包含两个跨膜结构域,N端和C端均位于细胞膜外,具有II型穿孔素的典型特征;原核表达结果显示单独表达X2-Lys和X2-Hol能抑制细菌生长,细菌在600 nm处的光密度值(Optical density,OD600)分别减少3.8%和10.3%,而共表达X2-Lys和X2-Hol严重抑制细菌生长(OD600减少70.0%)。电子显微镜观察结果显示单独和共同表达X2-Lys和X2-Hol的菌株形态均会发生变化,单独表达时细菌分别从短杆状变为球状和长杆状,而共表达菌株的细胞膜出现皱缩,胞内物质密度降低,菌株颜色明显变浅;β-半乳糖苷酶活性检测也显示共表达菌株比单独表达菌株呈现更显著的颜色变化,说明了对细胞膜更加严重的破坏。总之,上述生物信息学和生物学实验结果明确了噬菌体X2采用经典的“穿孔素-内溶素”双组份系统来执行裂解功能。其次,我们阐明了噬菌体X2内溶素X2-Lys和穿孔素X2-Hol的作用机制。通过Ni-NTA树脂纯化X2-Lys蛋白,蛋白质免疫印迹结果显示为单一条带,表明得到了纯化的X2-Lys蛋白;X2-Lys表现出体外溶菌效果,可使细菌数量在15分钟之内减少约40.9%,可能的机制是内溶素在外膜通透剂的帮助下,可与肽聚糖结构域直接接触,导致细菌的裂解;通过提取重组菌株28a-Hol的膜蛋白,蛋白质免疫印迹结果显示存在单一的条带,说明穿孔素X2-Hol定位于膜上,膜上的X2-Hol条带大小约为细胞质中穿孔素单体的2倍,结合上述“穿孔素-内溶素”双组份系统的特征化结果,推断穿孔素X2-Hol可能在膜上形成二聚体,进而形成孔洞,促进内溶素X2-Lys穿过细胞内膜,来发挥其水解细菌肽聚糖层的作用。最后,我们发现跨膜结构域（Transmembrane domain,TMD）在内溶素跨内膜转运中具有重要的功能。实验室前期的研究表明,TMD通过Sec分泌系统促进内溶素的易位;我们通过基因工程在内溶素X2-Lys上加了一段TMD,发现TMD也可以帮助X2-Lys不依赖穿孔素实现裂解细菌,提高内溶素X2-Lys的释放效率,导致细菌有效的裂解(12 h细菌OD600减少50.8%);此外,在大肠杆菌中表达穿孔素蛋白或者有TMD的内溶素均会引起细菌的形态变化,导致了菌体细胞变长,而单独表达不带TMD的内溶素却不会。由此我们推断TMD在裂解系统中可能具有双重功能:一个是跨膜转运,另一个是抑制细胞分裂。本研究在鉴定OP2家族噬菌体“穿孔素-内溶素”裂解系统的基础上,解析了其裂解水稻白叶枯病菌的机制,发现同一种内溶素可以同时通过依赖穿孔素和非依赖穿孔素的机制输出,丰富了噬菌体的裂解机制,对于噬菌体在水稻细菌病害防控上的应用也有着重要的意义。