论文部分内容阅读
间歇性缺氧(Intermittent Hypoxia,IH)是诱导心血管疾病发病率和死亡率增加的重要因素,可引起心肌细胞炎症反应,导致心肌细胞的促炎因子表达增加及炎症小体激活等,过度炎症还会造成心肌细胞死亡,诱发心脏功能障碍。炎症反应受到机体多种因素的调控,转录组学是筛选参与并调节炎症反应关键靶点的有效手段。因此,结合转录组学筛选调控炎症反应的关键基因可能成为干预间歇性缺氧诱导心肌细胞炎症反应的新策略。间歇性缺氧在细胞和分子水平上诱导心脏的氧化应激和炎症,调节氧依赖的基因表达,激活心脏细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)对损伤的应答,改变心脏组织ECM的组成和功能。近年研究表明,ECM对炎症也具有调控作用,缺氧引起的多种基质细胞蛋白差异表达,可作为炎症调节介质,调控氧化应激诱导的心肌细胞炎症反应。胞外蜂窝通信网络因子 1(Cellular Communication Network Factor 1,CCN1)作为ECM的基质细胞蛋白之一,在调节炎症方面具有重要作用,CCN1可通过自分泌和旁分泌途径调节细胞因子和趋化因子的产生,进而调控细胞的炎症反应,参与炎症性的发生发展。我们通过转录组学和生物信息学筛选间歇性缺氧后心肌细胞差异表达的关键基因为CCN1,因此我们推测,间歇性缺氧后关键差异基因CCN1,可能通过调节间歇性缺氧后心肌细胞的炎症反应,影响心肌细胞损伤的发生发展过程,在间歇性缺氧对心肌组织损伤过程中发挥关键作用。研究目的:本研究将首先确定大鼠心肌细胞H9c2间歇性缺氧模型条件,然后利用转录组学和生物信息学技术,明确间歇性缺氧后H9c2细胞差异表达关键基因及其核心富集通路,证明CCN1是间歇性缺氧诱导H9c2细胞炎症反应的关键调控分子,并初步探究CCN1调控炎症反应的机制,以揭示ECM功能蛋白在间歇性缺氧诱导的心肌细胞炎症反应中的重要作用。实验方法:本实验采用CCK-8方法,检测间歇性缺氧对H9c2细胞活力的影响,确定间歇性缺氧条件;并采用缺氧35 min复氧25 min的6个循环建立大鼠H9c2细胞间歇性缺氧模型,利用Western blot方法检测缺氧诱导因子HIF-1α蛋白表达;利用RT-qPCR和ELISA技术,检测间歇性缺氧诱导的常见炎症因子IL-6、TNF-α和CCL2的mRNA表达和分泌情况;采用RT-qPCR、Western blot及ELISA方法,检测炎症小体相关基因NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β的mRNA水平、蛋白表达及分泌情况,明确间歇性缺氧对心肌细胞炎症反应的影响。将对照组和间歇性缺氧组的H9c2细胞进行RNA-Seq分析,得到间歇性缺氧后H9c2细胞的差异表达基因;采用GO、KEGG富集分析,明确间歇性缺氧影响H9c2细胞的主要生物学功能和差异表达基因的核心富集通路;采用RT-qPCR方法,验证蛋白互作网络分析后评分排名前十二的差异表达基因,筛选和验证差异最显著的基因,并以此作为间歇性缺氧影响H9c2细胞炎症反应的关键基因进行后续研究。通过转染CCN1过表达质粒或CCN1 siRNA,过表达或抑制H9c2细胞关键基因CCN1,并利用RT-qPCR方法验证转染效率。采用CCK-8方法,检测H9c2细胞活力;采用RT-qPCR、Western Blot和ELISA方法,检测炎症反应相关指标,明确CCN1对间歇性缺氧诱导心肌细胞炎症反应的影响。通过String和Harmonizome数据库筛选与CCN1有相互作用的蛋白,并进行通路富集分析,筛选CCN1参与调控的炎症信号通路JNK/c-Jun,采用Western Blot方法,检测JNK/c-Jun通路蛋白,初步探究CCN1调控间歇性缺氧诱导心肌细胞炎症反应的作用机制。实验结果:1.间歇性缺氧诱导H9c2细胞的炎症反应H9c2细胞间歇性缺氧模型实验结果显示,6个缺氧35 min复氧25 min循环可导致H9c2细胞活力最低(p<0.01)。炎症反应相关指标结果显示,间歇性缺氧可诱导H9c2细胞炎症因子IL-6、TNF-α、CCL2 mRNA表达和分泌增加(p<0.05),炎症小体相关基因NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18和IL-1β的mRNA表达增加(p<0.05),NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达增加(p<0.05),以及 IL-18、IL-1β分泌增加(p<0.05)。上述结果表明,间歇性缺氧可诱导大鼠H9c2细胞的炎症反应。2.基于转录组学筛选间歇性缺氧后H9c2细胞差异表达的关键基因转录组学测序结果显示,H9c2细胞间歇性缺氧后有479个差异表达基因;GO、KEGG富集分析显示,间歇性缺氧后H9c2细胞的差异表达基因主要富集于细胞对缺氧的反应、细胞外基质及细胞炎症等条目,主要富集的通路为细胞外基质-受体相互作用通路,提示间歇性缺氧主要影响H9c2细胞的炎症和细胞外基质;结合蛋白互作网络分析及RT-qPCR实验验证重要差异基因Ccn1、Ccl2、Bmp4、Pgiiia、Vcam1、Igf1、Tnc、Comp、Thbs2、Myod1、Serpine1、Ptgs2、Itga3、Irs1、Thbs1、Itga6、Mapk1、Stat5的mRNA表达水平,筛选出了间歇性缺氧后H9c2细胞差异表达最显著的基因为基质细胞蛋白之一 CCN1(p<0.01);进一步研究发现,CCN1蛋白表达及分泌水平在间歇性缺氧条件下的H9c2细胞中也显著升高(p<0.05)。结果提示,CCN1是间歇性缺氧诱导大鼠H9c2细胞差异表达的关键基因。3.CCN1对间歇性缺氧诱导H9c2细胞炎症反应的影响基于CCN1在调控炎症方面的重要作用,我们继续探究CCN1对间歇性缺氧诱导H9c2细胞炎症反应的影响。H9c2细胞瞬时转染CCN1过表达质粒或CCN1 siRNA48小时,过表达或抑制H9c2细胞的CCN1。结果表明,转染CCN1过表达质粒在间歇性缺氧条件下,CCN1 mRNA、蛋白表达及分泌水平明显升高(p<0.01)。检测炎症指标结果显示,过表达CCN1可增加间歇性缺氧条件下H9c2的细胞活力(p<0.05),促进炎症因子CCL2的mRNA表达及IL-6的分泌(p<0.05),上调炎症小体相关基因IL-1β、IL-18 mRNA表达及NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表达(p<0.05),增加IL-18的分泌(p<0.05)。H9c2细胞瞬时转染CCN1 siRNA抑制CCN1表达48小时后,CCN1 mRNA、蛋白表达及分泌水平明显下降(p<0.05)。抑制CCN1表达可降低间歇性缺氧条件下H9c2的细胞活力(p<0.05),抑制炎症因子IL-6、TNF-α的mRNA表达和分泌(p<0.05),下调炎症小体相关基因 NLRP3、ASC、IL-1β mRNA 表达(p<0.05)及 NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达(p<0.05),减少IL-1β分泌(p<0.05)。结果提示,间歇性缺氧基于CCN1介导大鼠H9c2细胞的炎症反应,抑制CCN1可缓解间歇性缺氧诱导的大鼠H9c2细胞炎症反应。4.CCN1调控间歇性缺氧诱导H9c2细胞炎症反应的机制筛选CCN1参与调控的炎症信号通路为JNK/c-Jun。Western Blot实验结果显示,间歇性缺氧后H9c2细胞中p-JNK、p-c-Jun水平明显上升(p<0.05),JNK、c-Jun表达无明显变化。在间歇性缺氧条件下,抑制CCN1表达后H9c2细胞中p-JNK、p-c-Jun明显下降(p<0.01),JNK、c-Jun表达无明显变化。结果表明,抑制CCN1表达可抑制JNK/c-Jun通路蛋白的激活。实验结论:1.间歇性缺氧可诱导大鼠H9c2细胞的炎症反应;2.间歇性缺氧后H9c2细胞的差异表达基因主要富集于细胞对缺氧的反应、细胞外基质及细胞炎症等条目,CCN1为间歇性缺氧诱导大鼠H9c2细胞差异表达的关键基因;3.间歇性缺氧基于CCN1促进大鼠H9c2细胞的炎症反应,CCN1可能通过调控JNK/c-Jun通路影响炎症反应。