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背景:肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一,肝癌恶性程度高,预后差。目前肝癌的潜在分子机制仍然未被发现,所以手术和放化疗仍然是肝癌的主要治疗手段。但是由于肝癌细胞具有高度侵袭性,易发生转移,导致肝癌的预后差,生存率低。影响肝癌侵袭转移的因素有很多。研究表明,非编码RNA可以参与肿瘤的发生、侵袭转移、代谢、凋亡和耐药性等过程。非编码RNA根据长度可以分为两类,小非编码 RNA（＜200nt）和长非编码 RNA（Long non-coding RNA,lncRNA＞200nt）。lncRNA在表观遗传学上发挥重要作用,包括转录抑制,染色体失活等。已有研究表明,lncRNA在多种肿瘤中异常表达,能够调控多种肿瘤的进程,因此lncRNA有希望成为新的肿瘤治疗的分子靶点。HOX 转录反义 RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR）是一种lncRNA,长度为2158bp,位于第十二条染色体上。HOTAIR在肿瘤、糖尿病等多种疾病中发挥作用。HOTAIR在多种癌症中都呈现高表达,现在已经被当作一种致癌基因。HOTAIR在肿瘤中的高表达能够促进肿瘤的侵袭转移,导致肿瘤的复发,影响患者的预后,缩短患者的生存时间。因此,HOTAIR已经被当作肝癌的一种新的肿瘤标志物。除此之外,HOTAIR还能够通过调控多种分子,包括蛋白质,microRNA等,影响肿瘤的发生发展。MicroRNA（miRNA）是一种19～25 nt的内源性小非编码RNA,能够直接结合信使RNA（mRNA）的3’端非编码区（3’-UTR）来调控转录后的基因表达水平,从而抑制各种生物学和病理过程中蛋白质的转化。此外,miRNA已被证实在多种肿瘤中发挥重要作用,可以作为促癌或抑癌基因,参与调控肿瘤的发生和肿瘤细胞的增殖分化,侵袭转移,代谢和凋亡等过程。Fyn 家族相关激酶（Fyn Related Src Family Tyrosine Kinase,FRK）是一种非受体酪氨酸激酶,具有组织特异性。FRK在脑癌和乳腺癌中发挥抑癌功能,在肺癌,胰腺癌和肝癌中具有促癌功能。FRK是一种多功能信号转导分子,能够参与调控多条信号通路,包括EMT,Jnk和Akt通路等,是肿瘤的重要调节蛋白。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指上皮细胞失去极性,分化成间充质细胞的过程,是一种细胞分化过程。EMT在胚胎发育,肿瘤和纤维化疾病中起到促进作用。EMT激活后,上皮细胞间的紧密连接缺失,细胞失去极性,获得具有高迁移、高侵袭的间质细胞表型。因此,EMT的激活是肿瘤恶性转化的标志。本实验意在通过探讨HOTAIR/miR-144-5p/FRK轴通过EMT对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响,为肝癌的治疗提供新的靶点。目的:通过前期实验结果证明了 HOTAIR有助于增强肝癌细胞的侵袭迁移能力,测序结果表明了 HOTAIR过表达时miR-144-5p的表达呈下降趋势,FRK的表达呈上升趋势,但HOTAIR调控miR-144-5p的分子机制尚未明确,HOTAIR是否通过miR-144-5p调控FRK尚未可知。通过研究HOTAIR是否通过miR-144-5p调控FRK以及HOTAIR调控miR-144-5p的机制和miR-144-5p调控FRK的机制,阐明HOTAIR促进肝癌细胞侵袭迁移的新的分子机制,为预防肝癌侵袭迁移提供新的思路,为治疗肝癌提供新的靶点。实验方法:1基于RNA测序（RNA-Seq）的SmallRNA组学和转录组学分析并结合生物信息学预测网站及TCGA、GEO、GTExpert数据挖掘网站,将lncRNA-miRNA相互作用与miRNA靶基因mRNA相互作用结合起来,建立了 HOTAIR-miRNA-mRNA调控网络,系统地研究了 HOTAIR-miRNA-mRNA调控网络在HCC中的调节作用。2通过q-PCR实验检测肝癌组织中HOTAIR和FRK的表达量。3 通过 Transwell 实验检测 HOTAIR 和 miR-144-5p 对 HepG2 和 SNU-387 细胞侵袭能力的影响.4通过划痕实验检测HOTAIR和miR-144-5p对HepG2和SNU-387细胞横向迁移能力的影响。5通过q-PCR实验检测HOTAIR对miR-144-5p和FRK表达水平的影响。6通过Western Blot实验检测HOTAIR和miR-144-5p对FRK和EMT相关基因蛋白表达水平的影响。7通过q-PCR实验和CHIP实验证明HOTAIR通过PRC2途径间接调控miR-144-5p的表达。8通过双荧光素酶报告基因实验证明miR-144-5p直接调控FRK的表达。实验结果:1通过转录组测序结果分析发现HOTAIR过表达时,miR-144-5p表达下调,FRK表达上调。2通过荧光实时定量实验发现,与肝正常组织相比,肝癌组织中HOTAIR和FRK的表达水平均增高。3过表达HOTAIR,miR-144-5p的表达水平下降,FRK的RNA和蛋白表达水平均上升。敲低HOTAIR,miR-144-5p的表达水平上升,FRK的RNA和蛋白表达水平均下降。4转染miR-144-5pmimic,FRK的RNA和蛋白表达水平均降低;转染miR-144-5p inhibitor,FRK的RNA和蛋白表达水平均上升。5分别转染sh-HOTAIR和miR-144-5pmimic,HepG2和SNU-387细胞的侵袭能力和横向迁移能力变弱,Western Blot实验检测E-cadherin蛋白表达水平上升,而N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平降低。6 分别转染 p-HOTAIR 和 miR-144-5p inhibitor,HepG2 和 SNU-387 细胞的侵袭能力和横向迁移能力增强,Western Blot实验检测E-cadherin蛋白表达水平降低,而N-cadherin,Vimentin蛋白表达水平上升。7 转染 siEZH2,q-PCR检测 miR-144-5p 表达上调。转染 miR-144-5p mimic,Western Blot检测EZH2蛋白表达水平表达降低。转染miR-144-5p inhibitor,Western Blot检测EZH2蛋白表达水平上升。8 CHIP实验检测EZH与miR-144-5p TSS区域直接结合并诱导H3K27me3。9双荧光素酶报告基因实验检测miR-144-5p与FRK的3’-UTR直接结合。实验结论:1 HOTAIR能够作为分子支架,通过PRC2途径负调控miR-144-5p的表达。2 HOTAIR能够正调控FRK的表达,miR-144-5p能够与FRK的3’-UTR结合,负调控FRK的表达。3 HOTAIR能够通过EMT途径促进肝癌细胞的侵袭迁移,miR-144-5p可以通过EMT途径抑制肝癌细胞的侵袭迁移。4 HOTAIR/miR-144-5p/FRK轴可以调控肝癌细胞的侵袭迁移。