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microRNA (miRNA)是与转录后基因沉默相关的一类长度为21-23nt的重要RNA,最早在秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans)中发现[1]。现已证实,miRNA广泛存在于真核生物细胞内,是最大的基因家族之一,约占整个基因组的1%-4%。最近研究表明,miRNA功能广泛,在生物体内的多种生物学过程和调控途径中扮演着关键性角色,如发育进程控制、细胞生长与凋亡、细胞分裂、细胞分化与器官发育、病毒感染、维持机体生理活动的动态平衡等。它们通过依赖于miRNA和靶基因的互补性的两种不同的机制反向调控靶基因的表达。当miRNAs和编码蛋白质的mRNA几乎完全配对时,miRNAs诱导RNA介导(RNAi)的干扰途径；当这些miRNAs通过不完全的碱基配对和mRNA的3’非翻译区(UTRs),在一个类似于或者可能是等同于RNA干扰途径中使用的RISC复合物中,在转录后水平上抑制基因翻译。迄今为止,miRNA的研究工作主要集中在三个方向：1)miRNA的克隆和鉴定；2)miRNA的功能研究；3)miRNA的表达调控。其中,miRNA的表达调控的研究近年来发展迅速,引起了广泛关注。miR-122是一个肝脏特异性高表达的microRNA[2]。它除了在精子发生过程中有短暂低量表达以外[3],其他情况下都在肝脏保持着组织特异性的高表达。随后的功能研究发现,miR-122主要参与了以下几个方面的生物学事件：1)miR-122对于维持HCV的复制有重要作用[4]；2)miR-122参与精子发生过程[3]；3)miR-122参与脂类代谢过程[5,6]；4)miR-122与肝癌发生有关[7]。然而,对于miR-122如何实现肝脏特异性的高表达以及如何在脂类代谢过程中进行自身调节以保持脂类代谢的动态平衡我们还知之甚少。本研究以人miR-122为研究对象,探索miR-122肝脏特异性高表达及在脂类代谢过程中的表达调控机制。首先对人miR-122的基因组定位、进化保守性、前体可能的产生过程以及边界进行了生物信息学的分析。然后,利用Northern blot、RT-PCR和RACE对miR-122前体pri-miR-122进行分析；利用染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)研究pri-miR-122的染色质开放状态和转录机器；利用报告基因系统结合生物信息学分析以及序列删除和突变技术确定pri-miR-122的启动子区域以及可能结合的转录因子；利用逆转录病毒载体介导的基因过表达和RNA干扰(RNAi)技术验证转录因子对miR-122的调控作用。研究结果发现：人miR-122基因位于一个肝脏特异性表达的转录单元内,是由一个较长的前体非编码基因转录本通过剪切后而产生。这个前体转录本在进化上序列保守性不高,但其启动子区具有相当高的保守性。miR-122前体转录本包含两个外显子和一个内含子,具有一个相当长的3’-UTR,而miR-122茎环结构就位于其中。miR-122前体基因启动子区位于miR-122保守茎环序列上游约5kb处,包含多个核受体因子结合序列如DR顺式元件和明显的RNA聚合酶Ⅱ所识别的启动子顺式元件如TATA-box和CCAAT-box等,利用报告基因系统结合生物信息学分析以及序列删除和突变技术鉴定了这些元件对于miR-122基因表达具有十分重要的调节作用。对上述元件进一步进行生物信息学分析,推测在该启动子区可能存在多个与脂代谢相关的转录因子的结合位点,如HNF4、PPARa和FOXO家族等转录因子的结合位点。我们首先利用报告基因系统确定了HNF4对该启动子具有明显的正调控作用,当潜在的HNF4结合位点被突变后,再进行报告系统进行检测,HNF4的正调控作用明显下降,与对照组没有明显差异。随即我们利用染色质免疫共沉淀技术对Huh7细胞内源HNF4富集的片段利用针对该启动子的特异性引物进行扩增后发现,当在Huh7细胞内过表达HNF4转录因子时,miR-122的前体与成熟序列的表达都发生了比较明显的上调,而利用可以抑制HNF4表达的药物PMA[8]对Huh7进行处理后,miR-122的表达发生了明显的下调,说明HNF4对于miR-122的正常表达具有十分重要的调节作用。另外,我们利用荧光素酶报告基因检测系统对miR-122的潜在靶基因进行了筛选。根据sanger研究所miRbase数据库预测的数据,我们首先对miR-122的所有潜在靶基因进行了初步分析,其中与代谢相关的重要酶类占了相当大的比例。然后通过将表达miR-122的载体与在荧光素酶报告基因3’下游含有miR-122潜在靶基因的完整3’-UTR区的载体共转染293T细胞并设立严格的对照,验证了miR-122对其潜在靶基因的调节作用。研究结果发现,几个参与糖类和脂类代谢的关键基因、参与细胞周期调节的Cycling G1基因都受到miR-122的调节。说明miR-122在调节肝细胞代谢与增殖方面有着十分广泛和重要的调节作用。基于上述结果,我们提出了人miR-122在不同条件下(正常和不同胁迫情况下)动态调整和发挥调节功能的模型来解释miR-122参与不同生命活动事件的分子机制,为一些肝脏病变和代谢疾病提供治疗的思路。