研究背景:胃癌（Gastric Cancer,GC）是全球范围内第五大高发肿瘤疾病,居肿瘤死亡原因第二位。胃癌病因包括遗传因素、理化因素及感染因素等。在感染因素中,幽门螺杆菌与胃癌有关已达成研究者共识。除此之外,近年来EB病毒（epstein barr virus,EBV）也已引起研究者高度重视。EBV是1964年Epstein和Barr从非洲儿童Burkitt’s淋巴瘤培养细胞中发现的病毒,属人类疱疹病毒4型,即γ-型疱疹病毒,特异性人类嗜淋巴细胞性病毒。目前已知,EBV感染与多种人类恶性肿瘤如Burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌、传染性单核细胞增多症、霍奇金病及非霍奇金淋巴瘤等密切相关。1993年,Tokunaga等通过原位杂交技术证实胃癌细胞内存在EBV编码的小RNA,将之定义为EBV相关性胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）。2014年癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）根据分子水平的差异将胃癌分为四种分子病理亚型,包括EB病毒感染型、基因组稳定型、染色体不稳定型及微卫星不稳定型。其中,EBVaGC以其区别于其他类型胃癌的多种特质引起了广泛关注。据统计,EBVaGC约占全世界胃癌发病率的10%,且在不同地域间存在差异（[6]）。全面认识EBVaGC对胃癌发生机制研究及临床诊治有重要指导意义。表型特征是生物体从宏观到微观（即分子组成）、从胚胎发育到出生、成长、衰老乃至死亡过程中,形态特征、功能、行为、分子组成规律等所有生物、物理和化学特征的集合。全景解析人类表型特征,建立宏观表型与微观表型间多维度关联,是解析生命科技的重要线索。目前,对EBVaGC分子表型及临床表型特征等已有所了解,比如,EBVaGC中显示出PIK3CA的反复突变、DNA甲基化以及JAK2,PD-L1和PDL2过表达扩增等。然而,EBVaGC的分子模式非常复杂,包含多种遗传学和表观遗传学变异、转录组学及蛋白组学变异等,对此,我们的认知还十分有限,尚需深入探索,EBVaGC主要临床表型特征及具体发病机制也需要进一步深入研究。全面阐释EBVaGC表型特征可提供潜在的新型胃癌治疗靶标和路线图,可为制定胃癌精准诊治策略提供参考。EBVaGC致癌原因与EB病毒感染有关。病原微生物感染的基因组学和蛋白质组学研究旨在找出在病原体感染和宿主防御整个过程中影响重要生物学活动的关键蛋白以及这些蛋白的功能机制。对重要微生物的基因组学和蛋白质组学差异的鉴定不仅有助于深入了解其发病机制,还可为相关疾病的治疗提供新靶点。然而对于EBV感染导致的胃癌,目前几乎所有基因和蛋白水平的研究均聚焦于单一因素或基于生物信息学数据库的大样本数据集,仍缺乏通过独立采集质谱技术检测蛋白质组学变化建立的对EBVaGC基因和蛋白表达谱的综合研究。血清学检测,作为一种方便、非侵入性和成本效益高的检测手段,在人群流行病学调查、疾病过程的动态监测和风险预测方面显示出显著的优势。到目前为止,EBV血清学检测已经广泛应用于Burkitt淋巴瘤,鼻咽癌,霍奇金或非霍奇金淋巴瘤,睾丸癌等疾病的风险预测及早期诊断。然而,很少有研究集中于EBV血清学与胃癌风险的关系。此外,目前尚不清楚EBV血清学检测是否具有GC预测和预后的潜能。综上,本研究试图从基因变异、蛋白表达、病理组织学形态、血清抗体表达等不同层面,多维度探讨EBVaGC表型特征并筛选鉴定EBVaGC关联蛋白。对于已鉴定出的EBVaGC关联蛋白,我们进一步探究了其在EBV相关性胃癌中的分子调控机制。本研究为进一步探讨EBVaGC关联蛋白的作用机制奠定基础。研究目的:1.明确EBVaGC的表型特征。2.EBVaGC关联蛋白的筛选鉴定。3.明确EBVaGC关联蛋白GBP5的作用机制。研究方法:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别（一）EBVaGC差异表达基因分析利用公共数据资源GEO数据库检索包含EBV相关性胃癌信息的基因表达谱芯片,确定GSE51575作为分析芯片。该芯片包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本基因表达信息。采用GEO2R分析出该表达谱芯片的差异表达基因,|FC|>2.0,P<0.05为具有统计学意义。（二）EBVaGC差异表达蛋白筛选验证a)收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织共计132例。b)应用EBV编码RNA（EBER）原位杂交（ISH）技术对胃癌样本进行EBV原位检测。c)利用EBV阳性与阴性胃癌组织进行DIA-相对定量蛋白质组学分析,筛选具有差异表达水平的蛋白。（三）EBVaGC病理组织学特征分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年9月至2019年10月的胃癌手术患者癌组织及其癌旁正常组织标本共计132例。通过患者病历收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、淋巴结外肿瘤种植等临床病理信息。2.通过原位杂交检测EBV原位感染情况,进行分析。（四）EBVaGC血清EBV抗体表达分析1.收集中国医科大学附属第一医院自2012年11月至2020年6月的胃癌手术患者以及庄河胃癌高发现场患者血样本,其中包括浅表性胃炎、萎缩性胃炎以及胃癌病例共计1790例。在患者病历中收集性别、年龄、饮酒、吸烟、Lauren分型、浸润深度、癌周淋巴细胞浸润、脉管癌栓、淋巴结转移、周围神经侵犯、节外种植等临床病理信息。本研究获得中国医科大学第一附属医院研究所医学伦理委员会的批准,所有受检者均提供书面知情同意书。2.利用血清定量检测不同EBV-VCA IgG抗体滴度,分析其表达水平与EBV相关性胃癌发病风险、预后及临床病理参数的相关性。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究（一）GBP5原位表达与胃癌发病风险、临床病理参数及预后关系利用免疫组化技术对255对胃癌组织以及癌旁正常对照组织进行免疫组化染色,分析其与胃癌之间的关系。（二）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响1.GBP5过表达和沉默质粒的构建:分别选取GV146和GV102为GBP5的过表达以及沉默质粒载体,并经过酶切确认。化学合成GBP5基因序列,用Kpn I/Bam HI酶切含有目的基因的质粒,将酶切产物连接入线性化表达载体,经PCR鉴定。2.根据文献报道,选取EBV阳性SNU719胃癌细胞系以及EBV阴性AGS胃癌细胞系,并经过Real-time PCR确认EBV的表达,进行后续实验。3.采用CCK-8进行细胞增殖效应的检测。（三）GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响1.EBVaGC差异表达免疫相关基因的确定本研究经查阅文献后共总结出47个免疫相关基因,进一步将GSE51575中差异表达基因与47个基因取交集后筛选出差异表达的免疫相关基因。P<0.05被认为具有统计学意义。2.确定EBVaGC与GBP5相关的免疫基因采用斯皮尔曼相关分析方法分析GBP5与EBVaGC差异表达相关的免疫相关基因的相关情况。|r|>0,P<0.05具有统计学意义。3.验证EBVaGC免疫相关基因差异表达本研究收集GBP5过表达和沉默的SNU719和AGS细胞系培养液上清进行酶联免疫吸附实验对预测的GBP5相关的免疫基因进行验证。利用SPSS Statistics 24和Graph Pad Prism 8进行统计分析。P<0.05为具有统计学意义。（四）GBP5表达调控网络分析1.EBV相关性胃癌中GBP5蛋白互作网络构建本研究利用STRING在线工具（v11.0,https://string-db.org）预测GBP5蛋白互作网络。将GSE51575中差异表达基因与预测出的GBP5互作蛋白取交集,筛选出差异表达的GBP5互作蛋白,P<0.05被认为具有统计学意义。2.EBVaGC中GBP5与互作蛋白间的关联分析本研究利用斯皮尔曼相关分析计算GSE51575数据集中GBP5与其差异表达互作蛋白间的相关性。|r|>0,P<0.05被认为具有统计学意义。3.EBVaGC中GBP5与互作蛋白的通路分析对GBP5及其具有显著相关性的互作蛋白进行GO（包括生物学过程、分子功能和细胞组成）和KEGG富集分析,P<0.05具有统计学意义。研究结果:第一部分:EBV相关性胃癌多维度表型特征识别1.EBVaGC关联基因表达特征（EBV+胃癌vs EBV-胃癌差异表达基因）对包含12例EBV-阳性和14例EBV阴性胃癌样本的基因表达谱芯片GSE51575进行差异分析,结果显示在EBVaGC中共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）,其中排位前者包括CXCL17、GBP5、DMBT1、SLC6A8等。将EBVaGC表达的关联基因进行通路富集分析,结果表明统计学差异最显著的前10条通路均与机体免疫功能相关,例如抗原加工和呈递;辅助性T细胞1、辅助性T细胞2以及辅助性T细胞17分化、移植物抗宿主反应等。2.EBVaGC关联蛋白表达特征（EBV+胃癌vs EBV—胃癌差异表达蛋白）2.1基于EBV检测的金标准EBER-ISH,EBV感染细胞在遵照试剂盒说明书处理过后细胞核可以被显著棕染。结果显示132例胃癌样本中共有7例组织标本具有阳性EBER信号。2.2 EBVaGC的蛋白质组学研究采用上述7例EBV+胃癌样本及与之年龄性别临床病理参数匹配的7例EBV—胃癌样本进行DIA-相对定量蛋白质组学分析。结果显示与EBV-阴性胃癌组相比,在EBV-阳性胃癌组中共鉴定出137个差异表达蛋白。其中,GBP5、C5AR1、THRAP3、P3H3和MDK为47个上调蛋白中差异前五的蛋白。2.3本研究将GSE51575中差异表达的基因分别与鉴定出的差异表达蛋白取交集。结果发现共有25个基因在两组数据中均差异表达,其中GBP5在25个差异表达蛋白中差异表达倍数最高,其在EBV-阳性胃癌中相较EBV-阴性胃癌同样显著上调（P=1.19E-03,log2FC=3.21）,提示GBP5可能是一种与EBVaGC高度相关的蛋白。3.EBVaGC临床病理参数分析我们进一步对EBVaGC的组织病理学特征进行了分析。首先利用EBV原位杂交实验检测132例胃癌组织,结果显示7例具有阳性信号,EBVaGC检出率为5.3%。全部EBV+胃癌病例为中老年男性。其基本病理学特征为:全部病例为中晚期胃癌,多发于胃体部位（4/7,57.14%）;大体分型以溃疡/溃疡浸润型为主（6/7,85.71%）;组织学分型以中分化及低分化腺癌为主（6/7,85.71%）;绝大多数呈浸润性性生长（6/7,85.71%）;淋巴结转移多见（5/7,71.43%）;所有病例均存在癌周淋巴细胞浸润。免疫组化染色结果显示,Ki67指数较高,多伴有P53阳性表达（5/7,71.43%）以及EGFR与VEGF表达（4/7,57.14%）。EBV-阳性胃癌与EBV-阴性胃癌相比,临床病理参数未见显著差异（P>0.05）。4.EBV血清抗体表达与胃癌风险/预后的相关性在发病风险方面,分析1790例EBV-VCA IgG感染状态与不同胃疾病的组间比较发现,萎缩性胃炎组和胃癌组的EBV-VCA IgG阳性率均显著高于对照组（AG:40.0%vs.30.5%;GC:38.6%vs.30.5%）。经年龄和性别校正后,研究发现EBV-VCA IgG感染者罹患萎缩性胃炎和胃癌的风险分别提高到1.55倍和1.36倍（分别为P=0.001,95%CI=1.21-1.99;P=0.011,95%CI=1.07-1.72）。在胃癌预后方面,对临床病理资料齐全的234例胃癌患者进行了随访。结果发现,在肠型胃癌亚组,EBV-VCA IgG感染状态与总生存期有关,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差（Mean survival month:49.2 vs.61.3,P=0.009,HR=3.50,95%CI=1.37-8.94）。第二部分:EBV相关性胃癌关联蛋白GBP5的作用机制研究1.GBP5原位表达与胃癌病理参数/预后的相关性我们首先探讨了GBP5蛋白表达与胃癌组织病理学特征的关系,结果提示GBP5蛋白表达水平与浸润深度、脉管癌栓、淋巴结外肿瘤种植存在显著相关,在其他病理学参数的分组中未发现GBP5蛋白存在差异表达（P>0.05）。我们还分析了GBP5蛋白表达对胃癌预后的影响,单因素与多因素COX回归分析均未发现GBP5蛋白表达与胃癌预后具有相关性（P>0.05）。2.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞活性的影响EBV+SNU719和EBV—AGS细胞系中转染GBP5过表达质粒和对照质粒以及沉默和沉默对照质粒,分别观察两组细胞在24h、48h、72h的细胞活性。结果发现SNU719细胞系中,GBP5过表达组72h时的细胞活性较阴性对照组升高（P=0.001）,GBP5沉默组细胞活性较沉默对照组降低（P<0.001）。3.GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫相关基因表达的影响采用GSE51575芯片数据,利用GEO2R分析GBP5对不同EBV感染状态胃癌细胞免疫基因表达的影响,结果显示共有1088个基因上调,879个基因下调表达（|FC|>2.0,P<0.05）。进一步将47个免疫相关基因与GSE51575中差异表达基因取交集后发现23个基因在该芯片中存在差异表达,且均为上调表达,例如CXCL17等。4.GBP5表达与EBV相关性胃癌调控网络的关联分析本研究采用Sanger Box预测GBP5互作蛋白并确定其在EBVaGC中的差异表达情况,结果显示FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2和OASL可能为GBP5互作蛋白,且其在EBVaGC中均为上调表达,与GBP5存在显著的正相关关系。富集分析表明GBP5及其潜在的互作蛋白（OAS2、GBP2）可参与寡聚化核苷酸结合结构域样受体信号通路,提示EBVaGC中差异表达的GBP5、OAS2和GBP2可能通过影响此通路活性从而促进EBV相关性胃癌进展。研究结论:1.EBVaGC关联基因表达差异显著者有GBP5、CXCL17等,功能分析显示均与机体免疫功能相关。2.EBVaGC关联蛋白表达差异显著者有GBP5、C5AR1等,功能分析显示可能与乙醇降解Ⅱ类蛋白具有富集效应。3.EBV-阳性胃癌多见于中老年男性;胃体部位多发;溃疡/溃疡浸润型多见;中低分化腺癌多见,淋巴结转移多见。4.携带血清EBV-VCA IgG抗体者罹患胃癌发病风险升高;在肠型胃癌亚组中,EBV-VCA IgG阳性者的预后较EBV-VCA IgG阴性者更差。5.GBP5原位表达与胃癌不良临床病理参数正相关,尤其是与浸润深度、脉管癌栓以及结外肿瘤种植显著相关。6.GBP5可促进EBV阳性胃癌细胞增殖活性。7.在EBVaGC中,GBP5与23个免疫相关基因存在显著的相关性,其中CXCL17、IL-17、1L-8已经血清学表达实验证实。8.在EBVaGC中,GBP5表达调控通路生信分析结果提示,GBP5可与FCGR1B、TRIM22、GBP2、IRF1、OAS2、OASL互作。GBP5可能通过影响寡聚化域样受体信号通路活性从而促进肿瘤进展。