论文部分内容阅读
鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)是雏鸭的一种传播迅速、高度致死的病毒性传染病,由鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus, DHAV)和鸭星状病毒(Duck astrovirus,DAstV)引起,主要感染3周龄以内的雏鸭。根据2009年的国际病毒分类委员第十次分类报告,将DHV分为鸭甲肝病毒(DHAV),鸭星状病毒1型(DAstV-1),鸭星状病毒2型(DAstV-2)三个血清型。DHAV-1一直是我国流行的优势血清型,但近年来在我国关于DHAV-3的流行和DHAV-1与DHAV-3共流行的的报道越来越来,涉及的地区也越来越多,特别是DAstV-1在我国的出现又进一步增加了鸭病毒性肝炎的防治难度。为深入了解DAstV-1基因组变异情况,本研究对1株DAstV-1山东分离株WF1202进行了全基因组序列测定分析与单因子血清的制备。1、鸭星状病毒WF1202株的分离鉴定及全基因组测序与分析本研究应用RT-PCR方法扩增了Dastv-1中国山东潍坊分离株WF1202的不同核酸片段,并对其进行了全基因组序列测定与分析。测序结果表明,该株毒具有星状病毒基因的典型特征:在RF1a和ORF1b的重叠区存在一个7碱基滑动序列AAAAAAC,其下游存在一个可配对形成颈环结构的序列。序列分析结果表明该毒株与山东潍坊WF1201株的亲缘关系较近,全基因组核苷酸具有99.4%的同源性。2、单因子血清的制备与特异性检测本研究根据DAstV-1的GenBank已知序列信息,设计了1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增DAstV-1WF1202株ORF2全长基因片段,并将ORF2定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,得到的重组质粒转化进大肠杆菌Rosetta(DE3)PLys中,利用IPTG诱导表达得到大小为102KD的融合蛋白;Western blot分析发现该重组蛋白能与抗Dastv-1阳性血清进行反应,具有良好的免疫学活性。用纯化的重组蛋白作为抗原免疫昆明鼠,获得抗DAstV-1ORF2蛋白的鼠源单因子血清,并进一步验证其鸭星状病毒是否具有特异性中和作用,为鸭星状病毒的防治及该病毒蛋白功的能研究、ELISA检测方法的建立和病毒在鸭组织上的定位奠定了基础。