论文部分内容阅读
【研究目的】全球范围内共计有将近250,000,000的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的相关感染者,并且感染HBV病毒的患者有较高的可能性发展成为肝癌,而世界范畴内的HBV相关肝癌患者的死亡率在很长时间内居高不下。相关研究表明,整合到人肝细胞基因组中的HBV DNA片段促进了乙肝肝癌的发生发展,并且此种整合行为改变了宿主内源性基因的功能,诱导其染色体结构发生变异,使得癌基因活化、抑癌基因失活。本研究的目的在于揭示HBV DNA在乙肝肝癌患者外周血免疫细胞基因组中的整合这一现象,并为HBV相关疾病提供潜在的诊断标志物。【研究方法】在实验最开始的时候,我们采纳了全基因组的比较基因组杂交(Comparative Genome Hybridization,CGH)芯片这种技术对相关样本进行了全面的分析,筛选得到了在乙肝肝癌患者外周血免疫细胞基因组中拷贝数发生变异的相关基因,并采用定量聚合酶链式反应(Quantative-Polymerase Chain Reaction,Q-PCR)技术对结果进行了验证。我们利用1%的琼脂糖凝胶对本研究所涉及到的OR4F3与HBV的P基因片段所形成的融合基因进行了电泳分析。进一步地,我们利用MoFlo XDP细胞流式分选仪对不同的HBV相关疾病患者外周血中的免疫细胞进行了分选,得到了不同来源的CD3+T细胞、CD3-CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞以及CD3-CD14+单核细胞,并分离得到了来自分选得到的细胞基因组的DNA,分别逐个检测了HBV的DNA在其基因组上的是否存在整合的特异性。最后,我们利用受试者工作特征曲线(Reciever Operation Curves,ROC)评价了OR4F3与OR4F17作为诊断标志物的灵敏度和特异度。【实验结果】我们检测到了包括染色体19p,5q,1q和15p在内的基因拷贝数发生变化的数个染色体区域,其中共计包含有200个拷贝数增加的基因和270个拷贝数减少的基因。这其中,位于5号染色体5q35.3区域的OR4F3基因(嗅觉受体相关)与位于19号染色体19p13.3区域的OR4F17基因(嗅觉受体相关),其拷贝数在90%的样本中有明显的增加。另外,HBV基因组的P基因相关片段特异整合到了免疫细胞基因组上OR4F3基因的5’(Untranslated Region,UTR)非翻译区,而OR4F3基因的拷贝数变异很可能与HBV基因组P基因相关片段的整合有关,并且此种整合现象具有靶向NK细胞的特异性。进一步地,ROC曲线分析的结果表明,OR4F3与OR4F17可作为诊断HBV相关疾病的潜在标志物。【结论】研究结果表明,HBV的P基因相关片段特异整合到了OR4F3基因5’UTR区域,并且可能与导致乙肝肝癌患者外周血免疫细胞基因组中OR4F3基因拷贝数的变异有关。此外,我们的研究结果也表明,OR4F3与OR4F17可以作为诊断HBV相关疾病潜在标志物。