背景非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是以肝细胞脂肪变性和脂肪蓄积为主要特征,同时无过量饮酒史的一种临床病理综合征。NAFLD是一种常见的慢性肝病,在世界范围内广泛分布,目前认为NAFLD是与胰岛素抵抗(IR)密切相关,包含单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化。各种原因使肝内脂肪堆积超过5%或肝活检发现单位肝细胞中大约有1/3以上有脂肪滴者称为脂肪肝,其中NAFLD占80%。近年来,随着人们生活水平的改善,大量脂肪的摄入,肥胖、糖尿病的发病率增加,NAFLD的发病率明显增加,并有年轻化趋势,已成为病毒性肝炎之后第二大慢性肝病。非酒精性脂肪肝的发病率较前升高,单纯性脂肪肝有10%-25%的患者发展为NASH,10%-15%的非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者发展为肝硬化甚至肝癌。NAFLD的发病机制目前仍然未完全阐明。目前大家一致认同NAFLD与胰岛素抵抗、氧化应激、脂质过氧化、异常的炎症因子和线粒体功能异常等因素形成的“二次打击”学说密切相关。第一次打击是脂质代谢紊乱,导致单纯性脂肪肝,而以胰岛素抵抗、脂质过氧化、炎症反应及氧应激为核心的二次打击最终导致脂肪变的肝脏产生炎症、坏死甚至纤维化。JNK1在NAFLD的发生发展中起重要的作用,JNK1信号通路的激活是IR和炎性反应的主要影响因素。JNK1因敲除可以减轻炎症及高脂饮食诱导的IR和肝脂肪变,进而防止肝脏炎性反应和肝纤维化。目前认为TNF-α、FFAs、氧化应激均是JNK信号通路的特异性激动剂,同时它们都能干扰INS信号传导从而导致IR。脂联素是脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白,具有增加胰岛素敏感性、抗纤维化及抗炎等作用,在NAFLD的发生发展中起着重要作用。大量的动物和人体实验发现脂联素与肥胖、IR、冠心病及NAFLD密切相关。目前对NAFLD治疗局限于增加胰岛素敏感性、改变生活方式、减肥或外科手术治疗。转变生活方式、减肥或外科手术对大多数人来说很难实现,因此有效治疗NAFLD的药物是迫切需要的。利拉鲁肽是GLP-1类似物,与天然GLP-1有97%的同源性,通过增加胰岛素分泌、改善胰岛细胞功能、减少食物入量及体重等多种机制发挥降糖作用。目前动物和人体的实验发现GLP-1改善胰岛素抵抗及肝脂质沉积,对NAFLD有一定的作用。而利拉鲁肽是否能改善氧化应激、脂质过氧化及炎症反应尚未明确,利拉鲁肽的上述作用是否与脂联素含量及JNK信号通路有关及对NAFLD的影响目前尚无报道。本研究通过高脂饮食建立NAFLD大鼠模型,探讨利拉鲁肽对NAFLD大鼠的影响及机制。目的本研究利用高脂饮食建立NAFLD大鼠模型,通过观察利拉鲁肽药物干预后大鼠肝组织ADP、TG、TC、FFAs、MAD、SOD、TNF-α含量及血清ADP、TG、TC, TGF-β1、FBG水平的变化,同时观察大鼠肝组织JNK1、p-JNK1水平及p-JNK1/JNK1,探讨GLP-1类似物利拉鲁肽对NAFLD大鼠血清和肝组织脂联素含量及肝脏甘油三酯和游离脂肪酸含量,及对胰岛素抵抗、肝脏氧化应激及上述炎症因子的影响,进而探讨利拉鲁肽防止非酒精性脂肪肝病发生发展的机制,为开发有效的药物治疗提供依据。方法1、实验动物模型的建立雄性SD大鼠30只,购自中山大学动物实验中心,普通饮食喂养1周后随机分为正常组(ND组)10只,继续喂养普通饮食。高脂模型组20只,予高脂高胆固醇饲料喂养至第12周末,随机抽取老鼠正常组1只和高脂模型组1只处死,取部分肝脏和血液,检测高脂模型组血清甘油三酯、胆固醇、转氨酶及肝指数等显著增高,进行肝组织切片HE染色肝细胞明显脂肪变性确认制备模型成功,造模成功后,实验分组及干预措施如下：ND组,9只,予普通饮食+等剂量的生理盐水腹腔注射,时间13-16w; HFHC组,9只,予高脂高胆固醇饮食+等剂量的生理盐水腹腔注射,时间13-16w; GLP-1组,10只,予高脂饮食+利拉鲁肽0.6mg/(kg·d)腹腔注射,时间13—16w。实验动物自由饮水和进食,分笼6笼饲养,每笼5只,温度25℃左右、明暗各12h的动物室内。16周末,禁食12小时后予水合氯醛溶液腹腔麻醉处死所有大鼠,下腔静脉采血分离血清,取部分肝组织于液氮速冻后低温保存,另取部分肝组织行病理检查。2、肝指数实验结束时称体重和肝湿重,肝湿重/体重x100%,即为肝指数。3、血清中指标的测定将下腔静脉留取的血液3000r/min离心10分钟,取上层血清,通过全自动生化分析仪测定ALT、FBG、TG和TC,血清胰岛素(FINS)、脂联素(ADP)和转换生长因子β1(TGF-β1)采用酶联免疫吸附法测定,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=[空腹血糖(FBG)×FINS]/22.5。4、肝匀浆指标的测定精确称取相同部位的肝组织200mg,置于1.8ml匀浆介质,冰浴条件下2000r/min匀浆3-5分钟,制备成10%的肝组织匀浆。肝组织TNF-α和ADP通过酶联免疫吸附法测定,肝组织TG和TC使用GPO-PAP法检测,分光光度计测定肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)及游离脂肪酸(FFAs)。5、western blot测定肝组织JNK1及p-JNKl的表达取肝脏组织约100mg,液氮研磨后加入1ml蛋白裂解液,冰上静置30min后,4℃,20000xg,离心30min,取上清,BCA法蛋白定量。蛋白变性后,行SDS-PAGE电泳,湿转法将蛋白条带转移至PVDF膜上,脱脂奶粉室温封闭2h,分别加入JNK1抗体(1：1000)及P-JNK1抗体(1：200),于4℃摇床上孵育过夜,TBST洗膜后,加入二抗(辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG,1：5000),于4℃摇床上孵育2h,洗涤后用发光发显影曝光,用FluorChem8900软件进行分析蛋白条带。6、病理学检查部分肝组织以10%的中性福尔马林溶液固定,制备冰冻切片及石蜡切片,采用油红0染色及HE染色。7、统计学处理：采用SPSS16.0软件进行分析,其中计量资料均以均数±标准差表示；其中多组间比较,用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐者(P>0.05)用LSD检验进行组间的两两比较,方差不齐者(P<0.05)采用Welch校正法,组间两两比较用Dunnett’s T3法,等级资料采用Kruskal-Wallis H非参数检验进行分析,其中均以P<0.05具有统计学意义。结果1、大鼠体质量及肝指数的变化与ND组相比,HFHC组大鼠肝指数和体质量明显增高(P<0.05)；与HFD组相比,GLP-1组大鼠肝指数和体质量均显著下降(P<0.05):GLP-1组与正常饲养组相比,大鼠体质量无显著差异(P>O.05),肝指数增高(P<0.05)。2、大鼠糖代谢及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的变化模型组与正常饲养组相比,大鼠FBG和HOMA-IR明显升高(P<0.05),差别均有统计学意义。根据美国糖尿病协会糖尿病指南的标准：HOMA-IR>2.69为有胰岛素抵抗的标准,与正常组和GLP-1组相比,模型组老鼠出现糖耐量减低(IGT)和胰岛素抵抗(IR)等明显的糖代谢异常,利拉鲁肽治疗4周后,FBG和HOMA-IR明显恢复至正常。3、大鼠血清TG、TC、ALT和TGF-β1的变化与正常组相比,模型组血清TG.TC.ALT和TGF-β1水平明显升高(1.98±0.40vs.1.26±0.24mrnol/L,0.80±0.14vs.0.41±0.13mmol/L,59.44±12.43vs.46.56±6.39U/L,0.89±0.86vs.0.74±0.90ug/mL,P<0.05).与模型组相比,利拉鲁肽治疗后能明显降低血清TG、TC、ALT和TGF-β1的水平(1.36±0.20vs.1.98±0.40mmol/L,0.47±0.10vs.0.80±0.14mmol/L,48.90±10.57vs.59.44±12.43U/L,0.75±0.9lvs.0.89±0.86ug/mL P<0.05).4、大鼠肝脏氧化应激、脂质过氧化及炎症反应的变化发生NAFLD时,肝细胞中过剩的FFAs发生脂质过氧化,产生大量的ROS最终导致氧化应激。与正常组相比,模型组大鼠肝匀浆MAD,FFAs,TNF-α水平明显升高,同时SOD水平明显降低(9.12±2.60vs.6.50±1.79nmol/mg,153.1±32.9vs.105.2±26.9umol/g,3.0l±0.54vs.1.83±0.64ug/ml,172.3±6.3vs.188.7±13.0U/mg,P<0.05).我们观察到经过利拉鲁肽治疗后,大鼠肝匀浆MAD,FFAs,TNF-α水平明显降低,同时SOD水平明显升高(6.95±2.99vs.9.12±2.60nmol/mg,118.7±36.1vs.153.1±32.9umol/g,2.23±0.30vs.3.01±0.54ug/ml,193.4±7.1vs.172.3±6.3U/mg,P<0.05).5、大鼠肝脏脂质沉积及病理指标的变化正常组和GLP-1组未见脂肪沉积或炎症浸润,模型组出现明显的脂肪变及气球样变,油红0染色可见明显的肝脂质沉积,利拉鲁肽干预后可见肝内脂肪明显减少。6、大鼠血清及肝组织脂联素的变化脂联素可以改善糖脂代谢,在非酒精性脂肪肝的发生发展中起重要作用。与正常组相比,模型组血清及肝组织脂联素明显降低(68.1±2.5vs.74.9±6.4ug/L,124.6±12.9vs.150.1±18.9ug/L,P<0.05).经利拉鲁肽治疗后,大鼠血清及肝组织脂联素明显升高(74.8±7.1vs.68.1±2.5ug/L,148.4±19.2vs.124.6±12.9ug/L,P<0.05).7、大鼠肝组织JNK1、p-JNK1表达水平与正常组相比,模型组大鼠肝组织JNK1、p-JNK1表达水平及p-JNK1/JNK1明显升高(P<O.05)。经利拉鲁肽治疗4周后,JNK1、p-JNK1表达水平及p-JNK1/JNK1明显降低恢复至正常(P<O.05)。结论1、本研究使用高脂饲料喂养SD大鼠12周,成功的构建了SD大鼠NAFLD模型,该模型伴有IR、高脂血症、血清转氨酶升高等代谢综合症特征,符合人类脂肪肝的特征及演变过程。2、利拉鲁肽能明显改善NAFLD大鼠肝功能、糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗。3、利拉鲁肽能明显改善NAFLD大鼠肝氧化应激、脂质过氧化及炎症反应。4、利拉鲁肽能明显增加NAFLD大鼠血清及肝组织脂联素含量、降低肝组织JNK1、p-JNKl表达,可能是其降低NAFLD大鼠肝组织炎症指标水平、改善胰岛素抵抗和肝病理指标的重要机制之一。