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本研究对新城疫病毒(NDV)基质蛋白(M)的生物学功能进行了初步研究,试验包括6个部分,各个内容如下：1、M蛋白结构的生物信息学分析蛋白质的功能由其生物学结构决定,NDV M蛋白的功能研究目旧非常少,对其结构的认知也很肤浅。本文用生物信息学方法,对M蛋白翻译后修饰的磷酸化位点、糖基化位点、类泛素化位点、酰胺化位点和豆蔻酰化位点,线性motif和domain,B细胞抗原表位,T细胞表位,二级结构,亚细胞分布等进行预测分析,为今后研究M蛋白的结构和功能提供理论依据。2、M蛋白多克隆抗体的制备及其B细胞线性抗原表位分析通过构建NDV M蛋白原核表达载体,对M蛋白进行体外表达,经分离纯化后免疫小鼠,实时监测免疫效果,适时收集血清制备M蛋白多克隆抗体；同时利用生物信息学方法预测M蛋白B细胞线性抗原表位,对综合得分较高的寡肽序列进行人工合成,偶联BSA后免疫动物,对高免血清采用ELISA和Western blot进行表位验证。结论：成功表达M蛋白,成功制备M蛋白特异性的多克隆抗体,并且确证2个B细胞表位。3、稳定表达M蛋白DF-1细胞构建研究中使用PiggyBac转座子系统,将M基因随机转座到宿主细胞基因组中,阳性细胞带有GFP标签蛋白,用来指示外源基因表达情况。试验成功的将M基因整合到宿主细胞基因组中,并且能稳定表达。本试验成功建立M蛋白超高表达细胞模型：可以进行M蛋白稳定表达分析(降低瞬时转染的试验系统误差、提高M蛋白表达效率、提高试验的重复性水平)和过表达分析(感染野生毒株),也可以用作高通量试验的重要可重复材料。结论：成功的将M基因整合到鸡胚成纤维细胞(DF-1)中,M蛋白可以稳定表达。4、M蛋白细胞定位研究本研究通过生物信息学方法预测了新城疫病毒(NDV)基质蛋白(M)的细胞核定位信号(NLS),用Overlap-PCR的方法将NLS基因缺失,分别构建M和M-△NLS EGFP重组质粒,转染单层鸡胚成纤维细胞(DF-1),激光共聚焦观察了M蛋白细胞定位。结果表明,M蛋白能进入宿主细胞核中,缺失NLS序列之后M蛋白只分布于细胞质中,说明NLS决定了M蛋白的入核。结论：新城疫病毒M蛋白可以通过其核定位信号进入宿主细胞核。5、M蛋白对NIDV增殖的影响NDV的复制、转录、翻译的生物合成及病毒粒子装配的生命活动都是在宿主细胞质中完成,理论上M蛋白没有进入宿主细胞核的必要,但是研究已证实其M蛋白会进入宿主细胞核,那么M蛋白进入细胞核的生物学功能是什么?对病毒自身的增殖和致病有什么生物学意义?M蛋白是和宿主细胞核内的哪些蛋白质相互作用?M蛋白进入宿主细胞核内发挥哪些生物学功能不得而知,为了解释这些问题,进行内源性捕获宿主细胞与M蛋白相互作用的蛋白质,以及通过感染NDV来检测病毒对宿主细胞的损伤程度和病毒滴度,病毒基因的复制速率以及宿主细胞抗病毒成分基因表达的变化来证明M蛋白是否对NDV的增殖有作用。结论：利用稳定表达M蛋白的DF-1细胞,病毒滴度、CPE等结果无明显差异,超高表达M蛋白并不会影响NDV的增殖和致病性。6、M蛋白与宿主细胞相互作用蛋白质的捕获与蛋白质组学分析在研究中将M蛋白与一个小分子蛋白FLAG融合表达,在用免疫共沉淀(Co-IP)的方法捕获和富集与M蛋白发生相互作用的宿主细胞蛋白质,之后对捕获到的蛋白进行质谱鉴定。本实验通过M蛋白的瞬时表达和稳定表达分别鉴定出数种与M蛋白直接或间接相互作用的鸡成纤维细胞的蛋白质。结论：成功建立免疫共沉淀(Co-IP)方法,并用此方法捕获与M蛋白互作的宿主细胞蛋白质,用蛋白质组学分析鉴定到多种互作蛋白,为下一步深入研究M蛋白生物学功能打下基础。