草甘膦是世界上广泛使用的一种广谱性除草剂,其通过干扰植物体内指导芳香族氨基酸合成的莽草酸途径而导致植物死亡,从而达到除草效果。然而,草甘膦在杀灭杂草的同时不可避免地对作物的正常生长造成影响,并导致作物体内草甘膦的积累,进而对生态环境和人类健康构成潜在危害。甘氨酸氧化酶（GO）能够氧化断裂草甘膦分子的C-N键使其降解,从而解除了其对作物生长的抑制作用,同时降低了其在作物体内的残留量。因此,开展草甘膦降解型基因的研究对农业生产、生态环境和人类健康具有重要意义。本研究利用DNA shuffling技术对蜡状芽孢杆菌甘氨酸氧化酶B3S1进行了体外定向进化改良,从10,000个突变体中筛选获得一株活性最高的突变体B4S7。利用纯化的蛋白进行酶学动力学常数研究发现,B4S7对草甘膦的Km=0.1 mM,kcat=3.62 min-1,kcat/Km=36.2 mM-1 min-1,与B3S1相比其对草甘膦的亲和性和催化效率分别提高了 4.3 倍和 0.6 倍;B4S7 对甘氨酸的 Km=50.34 mM,kcat=2.18 min-1,kcat/Km=0.04 mM-1 min-1,与B3S1相比其对甘氨酸的亲和性和催化效率均降低。B4S7的特异性常数（kcat/Km,草甘膦与kcat/Km,甘氨酸之比）为836,相比于B3S1提高了 3.9倍。同时,B4S7对草甘膦的值远小于已报道的其他GO。此外,对B4S7进行酶学性质研究发现,其最适反应温度（60℃）和最适反应pH（8.5）与B3S1相同,热稳定性和pH稳定性也与B3S1类似;Fe2+对B4S7活性具有十分明显的抑制作用,Ca2+、Ba2+、Sr2+对B4S7活性有明显的激活作用。对B4S7进行序列分析发现,其与B3S1相比发生了 4个氨基酸突变,分别为V198I,F247S,S307L和G357E。利用软件MOE对B4S7进行结构模拟及其与底物草甘膦的分子对接发现,F247S这一新颖的突变位点靠近酶的活性中心。为了探究该位点的作用,通过定点饱和突变将其余19种氨基酸引入该位点。酶学动力学研究结果表明,与B3S1相比,当247位点的苯丙氨酸突变为丝氨酸和精氨酸时,酶的特异性常数分别提高了 0.64倍和2.01倍;当苯丙氨酸突变为谷氨酸时,酶的特异性常数降低2.1倍;当苯丙氨酸突变为脯氨酸时,酶失去活性。因此,该位点在调节底物特异性方面发挥着重要作用。基于已知甘氨酸氧化酶的报道,结合结构模拟,选定B4S7的54位点进行定点突变,利用PCR介导的环状突变法将该位点的丙氨酸突变为精氨酸（A54R）。对突变体A54R进行酶学动力学常数测定发现,其对草甘膦的Km=0.049 mM,kcat/Km=61.02 mM-1 min-1,与B4S7和B3S1相比其对草甘膦的亲和性分别提高了 1.04倍和9.81倍,催化效率分别提高了 0.8倍和1.89倍;同时A54R对甘氨酸的亲和性和催化效率进一步降低。A54R的特异性常数为1907,比B4S7提高了 1.28倍,比B3S1提高了10.26倍,这说明A54R的底物特异性发生了进一步改变。本研究为甘氨酸氧化酶的改良及其结构与功能关系研究提供了新信息,同时为草甘膦抗性作物的发展提供了 一定的基础。