【摘 要】
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日本乙型脑炎（JE）是由日本乙型脑炎病毒（JEV）引起的自然疫源性疾病,多发于夏季,其发病特点主要为发热、畏寒、肌肉疼痛和精神错乱等,死亡率高达20-50%,而且患者痊愈后留下较高比例的神经系统后遗症（Bunai Y et al 2015）。目前JEV的治疗缺乏有效的方案,疫苗接种仍然是预防该病最主要的措施。探讨干扰素刺激基因（ISGs）对JEV增殖的影响对于开发研制JEV新型的治疗药物提供了新的
【基金项目】
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国家自然基金（31170144）； 国家重点基础研究发展计划（973,2011CB504704）； 教育部新世纪优秀人才支持计（NCET-10-0402）；
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日本乙型脑炎（JE）是由日本乙型脑炎病毒（JEV）引起的自然疫源性疾病,多发于夏季,其发病特点主要为发热、畏寒、肌肉疼痛和精神错乱等,死亡率高达20-50%,而且患者痊愈后留下较高比例的神经系统后遗症（Bunai Y et al 2015）。目前JEV的治疗缺乏有效的方案,疫苗接种仍然是预防该病最主要的措施。探讨干扰素刺激基因（ISGs）对JEV增殖的影响对于开发研制JEV新型的治疗药物提供了新的思路和依据。本实验室前期研究表明干扰素刺激基因IFITM3对JEV的复制具有抑制作用,本研究旨在发掘更多的影响JEV复制的ISGs基因,并对其机制进行初步的探讨。主要研究内容如下:1.ISGs基因对JEV复制影响作用的初步筛选参照NCBI上公布的ISGs序列设计引物,以猪源组织cDNA为模板,扩增获得 ISG43,ISG15,OAS1,IFIT5,ISG12a,SERPINB9,XAF1 等 7 个猪源 ISGs基因,并与IFI6,IFI30,IFI35,IRG6,IFI44,GBP1,GBP2,BST2,MX2,IFITM1-3分别克隆入慢病毒载体pTRIP-CMV-3Flag-IRES-RFP,获得重组慢病毒质粒。在此基础上通过慢病毒包装系统获得慢病毒并分别转导BHK-21细胞,在确定外源ISGs基因表达的情况下,用0.1 MOI的JEV SX09S-01感染,并通过空斑和定量RT-PCR试验筛选对JEV的抗病毒效果。空斑试验和定量RT-PCR结果表明,在这19个ISGs基因中IFITM3的抑制效果最佳,极显著的抑制了 JEV的复制（P＜0.01）;其次是MX2,IFITM1,IFITM2和IFI44,与对照组相比显著地抑制JEV的复制（P＜0.05）;而ISG12a却能显著地促进JEV的复制（P＜0.05）。2.细胞水平上评价IFITM1和2对JEV增殖的影响为了在细胞水平上深入评价IFITM1和2对JEV增殖的影响,构建了稳定表达IFITM1和2蛋白的细胞系。利用慢病毒包装系统获得表达IFITM1-2的重组慢病毒,转导BHK-21细胞后,通过红色荧光信号、间接免疫荧光和蛋白免疫印迹等筛选并鉴定能够稳定表达IFITM1-2蛋白的细胞系BHK-IFITM1-2/RFP。0.1 MOI 的 JEV SX09S-01 感染 BHK-IFITM1-2/RFP,感染 24h 后收取上清和细胞进行空斑定量和Western blot检测。定量结果显示JEV在BHK-IFITM1-2细胞系上的复制拷贝数与对照组相比极显著降低（P＜0.01）,JEV的增殖滴度明显低于对照组（P＜0.05）,同时定量Western blot结果显示,BHK-IFITM1-2细胞系上JEV结构蛋白E的表达量明显低于对照组细胞系。3.IFITM1和2抑制病毒复制机制的初步探讨为了深入研究IFITM1和2对JEV抑制的抗病毒机制,基于IFITM蛋白家族的结构特点,以及已有的关于IFITM蛋白抑制囊膜病毒进入细胞的抗病毒机制,本研究进行了 JEV在BHK-IFITM1-2/RFP上的吸附进入实验。实时荧光定量结果表明,IFITM1并不能显著抑制JEV的吸附过程（P＞0.05）,且IFITM1对病毒的进入过程无明显作用（P＞0.05）。IFITM2对于JEV病毒的吸附过程无明显作用（P＞0.05）,但是能够显著抑制病毒的进入过程（P＜0.05）。
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