【摘 要】
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鸭病毒性肝炎是由3个不同血清型的鸭肝炎病毒引起的一种急性高度传染性疾病。2012年,国际命名委员会将血清Ⅰ型鸭肝炎病毒重新命名为小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒（DHAV）。血清I型鸭肝炎病毒（DHAV）是小RNA家族的成员,呈世界范围内流行。DHAV又分为三个基因型:DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。根据我国的流行病学调查,发现我国主要流行的毒株是DHAV-1和DHAV-3。近年来,
【基金项目】
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“猪流感病毒H1N1亚型灭活疫苗等联合开发及技术转让”项目；
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鸭病毒性肝炎是由3个不同血清型的鸭肝炎病毒引起的一种急性高度传染性疾病。2012年,国际命名委员会将血清Ⅰ型鸭肝炎病毒重新命名为小RNA病毒科禽肝病毒属的鸭甲肝病毒（DHAV）。血清I型鸭肝炎病毒（DHAV）是小RNA家族的成员,呈世界范围内流行。DHAV又分为三个基因型:DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。根据我国的流行病学调查,发现我国主要流行的毒株是DHAV-1和DHAV-3。近年来,时常有报道称针对于DHAV-1或DHAV-3主动或被动免疫的鸭群未能有效保护雏鸭免受DHV的攻击,仍爆发鸭病毒性肝炎。这说明我国部分地区已经是DHAV-1和DHAV-3混合感染的状况。由于DHAV-1和DHAV-3的临床症状和病理变化十分类似,所以仅是靠临床症状和病理变化特征并不能有效区分两种病毒,而且时常发生两种病毒混合感染的情况,这就给防治带来了极大的困难,严重危害了我国养鸭业的发展。本试验通过对湖北省某鸭场疑似鸭肝炎病毒感染的病死鸭肝脏进行病原的分离。使用本试验室建立的RT-PCR检测方法对分离毒株进行鉴定,扩增出与预期目的条带大小一致的929bp的目的片段。将通过测序获得的VP1基因序列在Gen Bank上对比分析,发现其与Ⅰ型鸭肝炎病毒基因C型SD1101毒株同源性达到98%。提取Gen Bank中具有代表性血清Ⅰ型鸭肝炎病毒的VP1蛋白编码基因序列进行遗传进化分析;结果表明该分离毒株的VP1基因序列与中国大陆分离的新型鸭肝炎毒株的序列同源性最高,属同一分支。雏鸭回归试验结果表明:用收获的鸭胚尿囊液接种非免疫7日龄雏鸭,试验组48h开始出现临床症状,60h后出现死亡、角弓反张等症状,病理解剖以及组织病理学切片均能观察到特征的病理变化,而对照组不出现任何的临床症状和病理变化。本试验对本实验室分离的DHAV-3毒株进行鸡胚适应传代的研究。通过尿囊腔接种的方式,将DHAV-3毒株在8日龄的SPF鸡胚上连续传代,使其适应鸡胚传代。对每代收获的尿囊液都利用本实验室建立的RT-PCR检测方法进行检测,均能扩增出特异性的目的片段。目前已传至53代,随着传代次数的增加,DHAV-3毒株已能适应鸡胚传代、稳定增殖。本试验对DHAV-3分离毒株的VP1基因进行RT-PCR扩增。然后将其连接到经过改建的原核表达载体PET-28a-tsf载体上,构建重组表达载体,命名为PET-28a-tsf-VP1。将构建成功的重组表达质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21中,然后经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和western blot分析,VP1蛋白得到了良好的表达,且是以可溶性蛋白形式存在。经纯化浓缩后,将该蛋白作为包被抗原建立检测抗DHAV-3血清抗体的间接ELISA方法。对抗原蛋白包被浓度、血清稀释度及酶标抗体工作浓度进行了摸索,确定了抗原蛋白的包被浓度为2μg/m L、血清稀释度为1:100及酶标抗体为1:500的最佳工作浓度。
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