糖尿病( diabetes mellitus,DM)是一种常见多发的代谢性内分泌疾病,已严重威胁着人类的健康。2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)是各型糖尿病中人数最多的一种,其各种慢性并发症归根结底是由血管病变和血管内皮功能紊乱引起。近年来,国内外许多学者从植物中提取、分离多种具有药理活性的化合物,其中以黄酮类最受重视。安徽医科大学药学院的前期研究表明:豹皮樟总黄酮(Total Flavonoids of Litsea Coreana ,TFLC)具有降糖降脂的作用。本研究首先通过高脂灌胃结合链脲佐菌素的注射建立一个伴胰岛素抵抗的2型糖尿病大鼠模型,然后采用TFLC连续灌胃6周,结果发现TFLC对伴有胰岛素抵抗T2DM大鼠体内发生的血管并发症具有一定的保护作用,其机制可能与减少肾组织和血管内皮细胞中JNK的磷酸化,改善血管舒缩功能,降低血清炎症因子浓度,促进高糖刺激下血管内皮细胞增殖,减少细胞凋亡和氧化应激等有关。1.伴胰岛素抵抗2型糖尿病大鼠模型的建立和评估目的:建立具有胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)特征、发病过程近似于人类2型糖尿病的大鼠模型。方法:将96只6周龄雄性SD大鼠随机分为高脂组(High-fat,HF,76只)和对照组(Normal Control,NC,20只),HF组予脂肪乳连续灌胃5月(10ml/kg/d),NC组则予蒸馏水灌胃(10ml/kg/d),每周测体重(body mass,BM)。5个月后测收缩压(systolic blood pressure,SBP)、空腹血甘油三酯(triglyeride,TG)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、空腹胰岛素(fasting insulin,FIns)等指标,并计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)。随机从两组中各抽取6只,行高胰岛素正常血糖钳夹实验测定葡萄糖灌流速率(glucose infusion rate,GIR)的变化,评价其胰岛素敏感性。HF组的其余大鼠每周给予腹腔注射12mg/kg的链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和0.5ml/kg的弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant CFA),以随机血糖>11.1mol/L为2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的成模标准,每只大鼠注射最多不超过3次。测定成模大鼠24小时尿微量白蛋白(microalbumin,mALB),采用透射电镜观察成模大鼠主动脉及肾脏内皮细胞的超微结构。结果:①与NC组相比,高脂灌胃5个月时HF组大鼠的BM、SBP、血TG及FIns均显著升高(P<0.05);ISI明显降低(P<0.05);FBG升高,但无显著性差异(P >0.05)。②HF组GIR水平较NC组明显下降(P <0.05)。③腹腔注射STZ和CFA后,共有53只大鼠随机血糖> 11.1mol/L,成模率达85.5%。④与NC组比较,透射电镜下可见DM组胸主动脉内皮细胞与管壁有分离现象,细胞内部分线粒体空泡变性,粗面内质网轻度扩张;肾小球毛细血管基底膜不均匀增厚,足突大部分融合,系膜增厚结构不清,基底膜局部增厚处见电子致密物沉积,血管内皮细胞内见部分线粒体空泡样变性。⑤DM组肾脏肥大指数及24小时尿mALB水平均明显高于NC组,差异均有显著性(P < 0.05)。2.豹皮樟总黄酮对伴胰岛素抵抗2型糖尿病大鼠代谢指标、炎症因子及胸主动脉血管舒缩功能的影响目的:观察TFLC对伴IR的实验性T2DM大鼠血管内皮功能、超微结构及炎症因子的影响;观察TFLC对正常SD大鼠离体胸主动脉环舒缩的影响,并探讨其可能的机制。方法:将伴IR的T2DM模型大鼠随机分为DM组、PIO组、TFLC小剂量组和TFLC大剂量组,TFLC组分别予200mg/kg·d、400mg/kg·d灌胃给药,PIO组予吡格列酮10mg/kg·d灌胃给药,连续治疗6周。测定BM、SBP、FBG、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin-A1c, HbA1c)、超敏C反应蛋白(high sensitive C-reactive protein,hs-CRP)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、内皮素-1(Endothelin,ET-1)、空腹胰岛素(Fasting insulin,FIns)等指标,电镜观察胸主动脉血管内皮超微结构的变化。建立正常SD大鼠的离体胸主动脉环灌流模型,随机分为NC组、TFLC组和PIO组,TFLC组加入不同浓度的TFLC(25、50、100mg/L),PIO组加入10μmol /L的PIO,观察TFLC对离体胸主动脉环舒缩功能的影响。结果:①与NC组相比,DM组血TG及LDL-C、CRP、ET-1、FBG、HbA1c、FIns、SBP、HOMA-IR水平均显著上升,NO、ISI水平明显下降(P< 0.05)。TFLC大剂量组和TFLC小剂量组、PIO组的上述各指标均较DM组明显下降(P < 0.05)。②DM组胸主动脉血管与管壁有分离现象,细胞内部分线粒体空泡变性,粗面内质网轻度扩张;TFLC大剂量组和小剂量组、PIO组仅发生轻度病理改变。③不同浓度的TFLC均可使有完整内皮血管环的基础张力显著下降(P<0.05);低浓度的TFLC(25mg/L)即可表现出血管舒张作用,且在一定浓度范围内(25-100mg/L)呈现浓度依赖性。3.豹皮樟总黄酮对高糖状态下SD大鼠血管内皮细胞JNK信号通路的影响目的:观察TFLC对高糖状态下SD大鼠血管内皮细胞的增殖及凋亡、氧化应激及JNK信号通路的影响,初步探讨TFLC保护血管内皮细胞的机制。方法:将培养的SD大鼠原代血管内皮细胞随机分为6组:正常组(Glu 5.5mmol/L),高糖组(Glu 47.5mmol/L),高糖+PIO组(Glu 47.5mmol/L + 1×10-6mmol/L PIO),高糖+高剂量TFLC组(Glu 47.5mmol/L +TFLC 100mg/L),高糖+低剂量TFLC组(Glu 47.5mmol/L +TFLC 50mg/L),高糖+SP600125(Glu 47.5mmol/L +SP600125 1.0μmol/L)。硝酸还原酶法和放射免疫法检测各组细胞培养上清中NO和ET-1的水平,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)和细胞凋亡,Western-blot检测JNK、p-JNK蛋白表达。结果:与正常组相比,高糖组中细胞培养上清NO水平明显下降,ET-1水平明显上升,细胞增殖明显减少,ROS水平明显升高,凋亡明显增加,pJNK水平明显上升(P<0.01)。TFLC能明显逆转高糖对细胞的各种影响,且呈剂量依赖性(P<0.05)。4.豹皮樟总黄酮对伴胰岛素抵抗2型糖尿病大鼠肾脏及JNK通路的影响目的:观察TFLC对伴IR的T2DM大鼠的肾脏病理变化及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)蛋白表达及磷酸化的影响,并探讨其保护T2DM大鼠肾脏的机制,为TFLC用于糖尿病合并肾脏病的治疗提供实验基础。方法:将第一部分建立的伴IR的T2DM大鼠模型随机分为模型组(DM)、吡格列酮(pioglitazone,PIO)组、TFLC小剂量和TFLC大剂量组,其中PIO组予吡格列酮10mg/kg·d灌胃给药,TFLC组分别予200mg/kg·d、400mg/kg·d灌胃给药。治疗6周后分别用HE、PAS、PASM染色观察各组大鼠的肾脏病理改变;免疫组化、RT-PCR和免疫印迹法分析肾脏组织中JNK的表达及磷酸化改变。结果:①3种染色结果表明:与NC组对比,DM组的肾小球体积增大,有核细胞数增多,囊腔狭小,基底膜不规则增厚,系膜基质增多。TFLC大剂量组、PIO组中的肾小球大小较正常,有核细胞轻度增生,囊腔狭小,基底膜及系膜基质轻度增厚。②免疫组化、RT-PCR和免疫印迹法的结果表明:DM组肾组织的JNK表达增高(P<0.05);TFLC和PIO组肾组织的JNK表达降低(P<0.05),免疫印迹法的结果发现TFLC大剂量组的pJNK表达显著降低。结论:1)长期高脂饮食结合腹腔注射小剂量STZ和CFA的方法可建立伴有胰岛素抵抗、主动脉血管和肾血管损害变化、高血脂及高血压的实验性T2DM大鼠模型,其发病过程近似于人类2型糖尿病。2)TFLC治疗可明显改善T2DM模型大鼠胰岛素抵抗,降低空腹血糖、糖化血红蛋白、甘油三酯及收缩压,抑制炎症反应,减轻T2DM大鼠胸主动脉及内皮细胞形态学损害,改善血管内皮依赖性舒张功能障碍;3)TFLC对血管内皮细胞有保护作用,25-100 mg/L TFLC可使高糖培养的血管内皮细胞存活力增强,分泌NO增加、ET-1减少,ROS水平和细胞凋亡减少,p-JNK水平明显下降;4)TFLC能减轻T2DM模型大鼠的肾脏病理损害,降低肾脏组织中JNK和p-JNK表达,其对肾脏的保护作用可能与降低JNK的表达及减少其磷酸化有关。