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蛋白质是生命的起源,生命活动的基础。它是由20种α-氨基酸通过肽键连接形成的高分子含氮化合物,由于氨基酸序列的不同而形成的立体结构构成了蛋白质结构的多样性。蛋白质具有一级、二级、三级、四级结构,蛋白质分子的结构决定了它的功能。蛋白质作为一种功能材料,可用于制备蛋白质固定相,用于化学和生物领域的分离。本文以牛血清蛋白和蛋白A为材料,制备了两类蛋白质固定相,用于手性分离和抗体纯化。 本论文主要进行了以下三个方面的研究: 一、牛血清蛋白手性固定相的制备与手性拆分性能研究 首先,以羰基咪唑作为偶联剂,通过柱上衍生法,将牛血清蛋白键合到氨化硅胶表面,得到键合型牛血清蛋白手性固定相。通过改变初始BSA浓度和键合时间等条件,来调控固定相上BSA键合量,并研究了不同键合量对手性化合物分离的影响。结果表明,固定浓度,随着键合时间的延长,初始键合浓度不断下降,当键合时间到达一定时长,键合浓度不再变化,说明此时键合量已保持不变;在相同的反应时间,蛋白质键合随BSA浓度的增大,键合量呈现先增大,后减少的趋势,在一定条件下键合量达到最大值为90mg/g硅胶。 然后,研究了BSA固定相对10种手性化合物的拆分,考察了不同键合量对样品保留和手性拆分的影响。结果表明,随着BSA键合量的不断增大,除加替沙星和去氧肾上腺素不能分离外,扁桃酸、L-苯、色氨酸、甲氨喋呤、安息香的选择因子和分离度呈现上升趋势,而色氨酸甲酯、亚叶酸钙、盐酸莫西沙星的选择因子和分离度,先上升,后略微下降。另外,扁桃酸、L-苯、色氨酸、和去氧肾上腺素、甲氨喋呤、亚叶酸钙的保留时间随BSA键合量的不同表现明显差异。随着BSA键合量的增大,扁桃酸在柱上的保留时间延长,L-苯、色氨酸、和去氧肾上腺素的保留时间基本保持不变,甲氨喋呤和亚叶酸钙的保留时间下降。 二、制备一种硅胶基质的蛋白A亲和固定相 采用羰基咪唑偶联-柱上衍生法将蛋白A键合到氨化硅胶表面,得到一种新的硅胶基质的亲和固定相,评价了蛋白A亲和固定相的分离纯化性能,研究了蛋白A初始浓度对键合量以及兔血清中抗体吸附量的影响,进一步研究了反应条件对抗体吸附量的影响。结果表明,随着蛋白A初始浓度的增大,蛋白A的键合量和兔抗体吸附量呈现先增大后减少的趋势;同时随着兔血清浓度升高和上样速度变慢,对抗体吸附量越大;经过SDS-PAGE电泳,抗体条带清晰可见,每单位质量的蛋白A可吸附2.29倍的兔IgG,抗体回收率可达95.7%,蛋白A亲和固定相的最大抗体饱和吸附量可达33.20mg/g硅胶。 三、蛋白A免疫亲和固定相的应用 用硅胶基质键合蛋白A用于抗体纯化的研究鲜有报道。本文制备了三款键合量不同的蛋白A固定相,纯化了一系列的单克隆和多克隆抗体;与GE公司的商品化的固定相对比其在纯化多克隆抗体、血清中的抗体方面的差异;最后与本课题组研制的琼脂糖基质的蛋白A固定相进行对比,考察不同基质对抗体纯化的影响。结果表明,本文制备的蛋白A亲和固定相在纯化单克隆和多克隆抗体时,纯化前后抗体效价基本不变、SDS-PAGE可看到清晰条带,可以很好的应用于抗体纯化领域。当待纯化的抗体总量较少时,本文制备的蛋白A柱与GE公司生产的蛋白A柱纯化效果相当;当待纯化的抗体总量非常大时,最大纯化量稍逊于GE商品柱。琼脂糖基质的蛋白A固定相抗体吸附量和吸附比例均高于硅胶基质,而抗体纯度不及硅胶基质。