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家蚕(Bombyx mori)是一种重要的经济昆虫和模式生物,研究家蚕滞育的分子机理具有重要的理论和实践意义。家蚕在长期的进化过程中形成了卵滞育的特性,其滞育性由遗传性和环境条件支配。根据家蚕的滞育性可将其分为一化性、二化性和多化性品种。家蚕二化性品种的滞育性受上代环境影响,卵期25℃高温明催青则产滞育卵,而15℃低温暗催青则产非滞育卵。家蚕胚胎滞育与蛹期咽下神经节(subpharyngeal ganglion,SG)合成和分泌的滞育激素(diapause hormone,DH)密切相关,而DH必须通过滞育激素受体(BmDHR)才能发挥作用。为了探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,本论文对Bmdhr基因的结构、表达谱和功能特性进行了初步研究。1、Bmdhr基因结构分析从NCBI下载Bmdhr mRNA-1~Bmdhr mRNA-5的序列(登录号:AB164386 ~AB164390),在家蚕基因组数据库进行在线基因组比对,用DNASTAR软件包进行ORF分析并推导其相应的氨基酸序列;用TMHMM service v. 2.0程序分析蛋白跨膜区。结果显示,Bmdhr为单拷贝基因,全长约33.79 kb,包含7个外显子和6个内含子;其5个mRNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mRNA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,为同一种受体;BmDHR-1含有7个跨膜区域,BmDHR-3、BmDHR-4和BmDHR-5分别含5个跨膜区域。2、Bmdhr基因的时空表达特性及催青温度对表达的影响将家蚕二化性品种“秋丰”的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR技术分析了催青温度对家蚕不同发育时期及组织中Bmdhr基因mRNA转录水平的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青高于低温催青;Bmdhr mRNA-4主要在各发育时期的血液中表达,在高温明催青下,其在蛹体血液中的转录水平是低温催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种次代是否滞育的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2~3 d的卵巢中转录水平较高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平下降,至化蛹后4~5 d时2种催青处理间的转录水平无显著差异。3、Bmdhr基因启动子特性分析在生物信息学分析的基础上从家蚕基因组DNA中克隆了包含不同调控序列的Bmdhr基因的启动子,使用pGL3.0 basic载体构建了报告质粒,对不同长度的启动子序列进行了活性分析,比较了不同浓度的保幼激素类似物(JHA)、蜕皮激素(MH)和滞育激素(DH)及激素组合对Bmdhr基因启动子活性的影响。结果显示,Bmdhr转录起始位点上游-941～-1364 nt区间可能存在负调控元件。MH浓度为4μg/mL时,启动子的活性显著减弱,其余浓度则极显著增强。JHA浓度分别为2、4、6、10μg/mL时,启动子活性极显著增强,而1μg/mL时显著减弱, 8μg/mL时则极显著减弱。MH和JHA浓度均为1、2、4、6μg/mL时,启动子活性显著增加,其中1μg/mL时活性最高;而二者浓度均为8、10μg/mL的条件下,启动子活性变化不显著。DH浓度在0~60 nM之间,启动子活性显著增加,其中20 nM左右活性最高,浓度大于60 nM时,启动子活性变化不显著。4、BmDHR的真核表达及功能分析以pcDNA3.1载体为骨架,构建了IE-1启动子-BmDHR表达质粒,并分别检测了各种BmDHR对家蚕海藻糖酶基因(Bmtrehelase)启动子活性的影响。结果显示,4种滞育激素受体BmDHR-1、BmDHR-3、BmDHR-4和BmDHR-5分别单独大量表达时,均能上调下游海藻糖酶基因启动子的活性;不同比例(1:3、1:1和3:1)的BmDHR-1 /BmDHR-5均能上调海藻糖酶启动子活性,并且二者共同强表达时BmDHR-5有一定的抑制作用;BmDHR-1/BmDHR-5比例为1:3时,上调倍数与BmDHR-1单独作用时相当。本论文研究了Bmdhr基因的结构、表达谱和功能特性,为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。