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糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,是一种外切型糖苷酶,含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,分子量在50kD-112kD之间,通常碳水化合物占总量的3.2%-20%。其功能在于从淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非还原性末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶底物专一性较低,它除了能从非还原性末端断裂a-1,4-糖苷键外,也能水解a-1,6-糖苷键和a-1,3-糖苷键。该酶广泛分布于细菌、古细菌和真核生物中。在工业上用于将淀粉转化为葡萄糖,因而广泛地用于制药、酿酒及食品发酵工业中,是最重要的工业酶制剂之一。目前,年产量约70000t,是中国产量最大的酶种。本文从高产糖化酶的黑曲霉BU11-36的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,经Sac I酶切线性化开后,通过电穿孔法将线性重组质粒整合到毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6U/mL。测序结果显示其糖化酶大小为1908bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子量大约为80k Da。重组糖化酶酶学特性测定显示：该酶最适反应pH和温度分别为5.0和50℃Cu2+对重组糖化酶的抑制作用明显强于Fe3+、Ca2+、Zn2+。非离子型的表面活性剂(TritionX-100、吐温-20、吐温-80)对糖化酶有提高的作用,而阴离子表面活性剂(SDS)对糖化酶有抑制作用。利用相同的方法将黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pYES2相连,构建重组载体,电转化酿酒酵母INVScl,经碘熏染法筛选阳性克隆并进行研究。重组酿酒酵母的糖化酶最大酶活为4.3u/mL,重组酿酒酵母糖化酶的最适反应温度为55℃。重组糖化酶的最适反应pH为4.0,淀粉水解力大约为60%,重组酿酒酵母的酒精发酵能力为3.5%。SDS-PAGE电泳显示重组酿酒酵母分泌蛋白的分子量约为70kD。