目的：恶性胶质瘤,是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,已成为危害人类健康的重要脑部疾病。化疗是其临床综合治疗的重要手段之一,是治疗晚期恶性肿瘤以及防止复发必不可少的。然而,对于占恶性肿瘤90%以上的实体瘤,化疗尚未能取得满意的效果。且化疗药物对肿瘤细胞与正常细胞的选择性较差,对人体往往产生一定的毒副作用。因此,寻找高效、特异和低毒的抗肿瘤药物是肿瘤防治研究中的重要课题。Nodosin是从唇形科香茶菜属植物中提取出来的一种五环二萜类化合物,来源广泛,具有抑菌、抗炎等作用。本课题以恶性胶质瘤细胞株C6、U87和C6移植瘤模型为研究对象,研究nodosin对脑胶质瘤的抑制作用,并探讨其作用机制,为其临床抗胶质瘤的研究提供有力的实验依据和理论基础,为进一步开发新型抗胶质瘤药物扩展新视野。方法：采用倒置显微镜对胶质瘤细胞进行形态学观察；采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生存率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞毒性,BrdU检测法检测细胞增殖情况；应用流式细胞仪技术研究nodosin对细胞周期的影响；采用Hoechst33342染色法、原位末端标记技术(TUNEL)法观察nodosin对细胞凋亡的影响。采用western blot方法对细胞周期相关蛋白cyclin B1和cdc2和细胞凋亡相关蛋白bcl-2、Bcl-xL、 Bax、Bak及相关胶质瘤细胞内信号通路的蛋白水平进行检测；以及通过对caspase-3/7、caspase-8、caspase-9活性检测和细胞线粒体膜电位的测定(JC-1染色),来研究nodosin抑制胶质瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡的机制。同时,应用GSK3β抑制剂LiCl联合nodosin,研究nodosin对细胞凋亡的影响。选择划痕实验和Transwell细胞迁移、侵袭实验评价nodosin对胶质瘤细胞的侵袭迁移能力；应用激光共聚焦扫描显微镜对胶质瘤细胞骨架进行观察,并通过western blot方法检测MMP-9的蛋白含量来研究nodosin对胶质瘤细胞的迁移与侵袭的机理。通过建立大鼠恶性胶质瘤细胞株C6细胞皮下移植瘤模型,探讨在在体条件下nodosin对肿瘤体积、肿瘤重量等的影响,并通过HE染色观察肿瘤病理组织学的改变。成果：MTT结果显示nodosin对胶质瘤细胞的生长有明显的抑制作用,且呈现明显的量效、时效关系,处理细胞24h后,对大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U87细胞的IC50分别为：25.81μM、11.05μM;而nodosin在24h时对人正常胶质细胞HEB及大鼠原代胶质细胞的存活率影响不大,其IC50分别为：32.06μM、46.69μM。LDH检测发现,nodosin对C6及U87没有细胞毒作用。这些结果表明,nodosin的抗肿瘤作用具有较强的细胞选择性,其抗肿瘤作用机制可能与细胞周期阻滞、细胞凋亡诱导和侵袭转移抑制有关。BrdU检测法和流式细胞术检测结果显示,nodosin对C6及U87胶质瘤细胞具有较好的增殖抑制作用,通过使胶质瘤细胞组滞于G2/M期的机制,抑制胶质瘤细胞进入下一增殖周期,从而抑制胶质痈细胞增殖。Western blot法实验显示,5μM、10μM、15μM的nodosin处理C6、U87细胞24h后,cyclinBl和cdc2蛋白表达水平下调。细胞形态学观察、Hoechst33342染色法染色以及原位末端标记技术(TUNEL)检测结果显示,nodosin能诱导胶质瘤细胞的凋亡,作用胶质瘤细胞24h后,细胞形态发生改变,细胞数量与密度减少,随着剂量增加,培养基中悬浮的死亡细胞增多,出现染色质边集,细胞核碎片化,凋亡小体形成。Caspase活性检测发现,nodosin能够增加C6、U87细胞中caspase-3/7、caspase-8、caspase-9的活性,并成一定的剂量依赖关系,提示着我们,nodosin诱导胶质瘤细胞凋亡的作用,既通过死亡受体通路,亦通过线粒体通路。Western blot法结果显示,nodosin能够下调Bcl-2、Bcl-x1蛋白表达水平,上调Bak蛋白的表达水平,Bax蛋白水平不变；同时,能抑制P38MAPK、 PI3K/Akt和PKC信号通路；应用GSK3β抑制剂LiCl联合nodosin,发现LiCl可阻断nodosin引起的细胞凋亡。划痕实验和Transwell细胞迁移、侵袭实验结果显示,nodosin能够剂量依赖性地阻止胶质瘤细胞的迁移与侵袭；cofocal结果发现,nodosin可抑制微管聚集；western blot分析结果显示,5、10和15μM的nodosin能以剂量依赖方式减少MMP-9蛋白表达水平。提示,nodosin对胶质瘤细胞的迁移侵袭抑制机制与其促进细胞微管解聚以及下调MMP-9蛋白表达水平相关。接种胶质瘤C6细胞后第3d,对照组和nodosin组的肿瘤生长没有明显差异。接种后第4d到第12d,对照组的肿瘤生长快速,nodosin组的肿瘤生长缓慢,差异有显著性意义(P<0.05)；裸鼠肿瘤重量、肿瘤体积增长率均明显小于对照组。HE染色显示,对照组C6胶质瘤细胞丰富密集,坏死很少,nodosin组C6胶质瘤细胞生长密度低于对照组,并可见到细胞体积变小,核固缩深染的凋亡形态学改变,部分区域出现液化坏死。结论：(1)首次在胶质瘤细胞模型上研究nodosin抗恶性胶质瘤的作用,发现nodosin对胶质瘤细胞的生长具有明显的选择性抑制作用；(2) Nodosin对胶质瘤细胞具有细胞增殖抑制作用,这种作用通过阻滞细胞周期于G2/M期以及下调cyclinBl和cdc2蛋白水平来实现；(3) Nodosin具有诱导胶质瘤细胞凋亡的作用,其机制为：nodosin通过增加Caspase-3/7、Caspase-8、Caspase-9活性、降低线粒体膜电位、下调Bcl-2、Bcl-x1蛋白的表达水平以及上调Bak蛋白的表达水平来诱导胶质瘤细胞凋亡；nodosin能抑制P38MAPK、Akt和PKC等相关胶质瘤细胞内信号通路的蛋白水平；GSK3β在nodosin诱导细胞凋亡中是必需的。(4) Nodosin能通过促进细胞微管解聚以及下调MMP-9蛋白水平来抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭。(5)首次在体内实验中,发现nodosin能抑制裸鼠内胶质瘤的肿瘤生长及减少肿瘤重量,具有体内抗恶性胶质瘤作用。