【摘 要】
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背景:胰腺癌（PAAD）是恶性程度极高的常见的消化道肿瘤之一,其发病率逐年上升,但患者的五年生存率并没有明显改善。主要原因在于其特殊的解剖位置使其难以被早期发现,病人就诊时多已失去手术机会。另外胰腺癌肿瘤微环境的重塑,基质成分增多及乏血管特性等原因导致以吉西他滨为核心的化放疗方案效果有限。以PD-1/PD-L1单抗为代表的免疫检查点抑制剂已被证明在胰腺癌中基本无效。因此,亟待寻找新的胰腺癌治疗靶点
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No. 82073178）；
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背景:胰腺癌（PAAD）是恶性程度极高的常见的消化道肿瘤之一,其发病率逐年上升,但患者的五年生存率并没有明显改善。主要原因在于其特殊的解剖位置使其难以被早期发现,病人就诊时多已失去手术机会。另外胰腺癌肿瘤微环境的重塑,基质成分增多及乏血管特性等原因导致以吉西他滨为核心的化放疗方案效果有限。以PD-1/PD-L1单抗为代表的免疫检查点抑制剂已被证明在胰腺癌中基本无效。因此,亟待寻找新的胰腺癌治疗靶点,而探索胰腺癌发生发展的分子生物学机制对开发新的治疗靶点有重要意义。最近的研究发现,含FYVE、Rho GEF和PH结构域蛋白3（FGD3）在多种肿瘤中发挥抑癌作用,能改善病人的预后。然而,FGD3在胰腺癌中扮演的角色尚未见文献报道。据此,本研究拟探索FGD3在胰腺癌的发生发展中扮演的角色和相关的分子生物学机制,为胰腺癌治疗新方案的开发提供相应的理论依据。方法:本研究利用TCGA数据库评估胰腺癌和癌旁组织中FGD3的表达差异,通过分析数据库中高表达FGD3组和低表达FGD3组胰腺癌病人的临床资料,探索FGD3是否与病人预后相关。随后借助临床病人标本及组织芯片（TMA）数据进一步验证胰腺癌中FGD3的表达变化。为探究FGD3在胰腺癌中的生物学功能,将多种胰腺癌细胞系敲低、过表达、先敲低后过表达FGD3,构建稳定敲低/过表达FGD3的细胞株;利用CCK-8、平板克隆形成、Transwell侵袭实验以及划痕实验等在细胞水平研究FGD3对胰腺癌的影响;并构建小鼠皮下瘤、肺转移模型在动物水平进一步验证。为探究FGD3的作用机制,将敲低FGD3的PANC-1细胞系进行转录组测序,结合生物信息学分析推测FGD3可能的作用机制;将过表达FGD3的PANC-1细胞经免疫沉淀后进行质谱-蛋白质组学分析,寻找与FGD3相互作用的蛋白;为更深入探究FGD3的作用机制,利用免疫共沉淀（CO-IP）、谷胱甘肽S-转移酶下拉实验（GST-pulldown）、免疫荧光（IFC）染色评估FGD3与HSF4之间的相互作用;染色质免疫共沉淀-定量逆转录PCR（Ch IP-q PCR）等实验评估HSF4对p65的调控作用。结果:与正常胰腺组织相比,胰腺癌中FGD3表达水平明显下调,这一现象在包括TCGA在内的多个数据集中都能观察到;临床数据显示低表达FGD3的胰腺癌病人伴随更高的远处转移率,更晚的病理分期,更短的总体生存期。敲低FGD3可以促进胰腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭能力,反之过表达FGD3则可抑制胰腺癌细胞系的增殖、迁移、侵袭能力;动物实验证实FGD3有抑制胰腺癌增殖、肺转移的作用。RNA-seq联合生物信息学分析发现敲低FGD3后NF-κB通路明显上调,而NF-κB通路中p65的蛋白和m RNA水平上调尤为明显,在临床数据中也观察到低表达FGD3的病人中存在明显的NF-κB通路上调。细胞实验中过表达/敲低FGD3后可以观察到p65随之下降/上升,并且FGD3促进上皮间质转化中上皮标志物ZEB1、Ecadherin的表达而抑制间质标志物Vimentin的表达。随后,质谱-蛋白质组学分析鉴定出FGD3在PANC-1细胞中可结合101种蛋白,其中唯一的转录因子是HSF4且HSF4的表达量不受FGD3的调控。CO-IP和GST-pulldown实验证实FGD3与HSF4的结合发生于各自的C端,胞质胞核蛋白分离实验及IFC实验证实FGD3结合HSF4后抑制HSF4入核。敲低/过表达HSF4后p65表达随之下降/升高。Ch IP-seq数据提示HSF4可富集于p65的启动子区域,Ch IP-q PCR随后证实HSF4可结合于p65启动子区域。胰腺癌细胞系中敲低HSF4能逆转敲低FGD3所致的p65表达升高,过表达HSF4能逆转过表达FGD3所致的p65表达下降。结论:本研究证实FGD3在胰腺癌中低表达,且FGD3低表达与较差的预后相关,FGD3可以抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力及EMT;机制上,FGD3通过与HSF4结合发生相互作用,抑制HSF4入核从而抑制p65的表达下调NF-κB通路抑制胰腺癌进展;HSF4作为转录因子直接促进p65的转录水平;本研究在胰腺癌中发现了一个新的FGD3/HSF4/p65调控轴,该调控轴的发现为开发胰腺癌治疗新靶点提供理论基础,同时也加深了对胰腺癌中重要分子p65调控机制的理解。
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