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转录因子ATF/CREB(Activating transcription factor/cAMP response element binding protein)家族是一大类碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper,bZIP)蛋白,参与多种细胞生命活动,包括细胞存活、增殖、分化、凋亡等过程。基因复制是产生基因组复杂性的关键,而全基因组复制为进化适应和创新提供了大量的原材料。研究表明,真核生物中bZIP蛋白的多样化与多细胞生物的进化有关。近年来,ATF/CREB家族的全基因组鉴定工作在一定程度上已经在植物及少数几种哺乳动物(如人和小鼠)中开展。然而,该家族在大多数动物类群中的全基因组鉴定工作,特别是在鱼类,却鲜有报道。ATF/CREB家族在动物界的起源、演化过程不清楚,其家族扩张与在脊椎动物发生的四次全基因组复制的联系有待研究。ATF/CREB整个家族的表达模式也未见报道。Creb1作为ATF/CREB家族的一员可能参与了哺乳动物的卵子发生和精子发生。在四足动物中只有一个Creb1,而在真骨鱼中保留了两个拷贝,creb1a和creb1b。已有研究表明,creb1a和creb1b分别在罗非鱼的卵巢和精巢中高表达。由于没有直接敲除Creb1的证据,其在配子发生中的具体作用仍不清楚。本研究分离鉴定了不同动物类群,共22种代表性动物的ATF/CREB家族成员,全面系统的分析了该家族在动物界的起源与演化,包括全基因组鉴定、基因定位、系统发育和共线性分析。此外,基于尼罗罗非鱼成体八个不同组织以及雌雄性腺发育的四个关键时期的转录组,分析了ATF/CREB整个家族在尼罗罗非鱼的表达模式。此外,以尼罗罗非鱼为研究对象,制备了Creb1b多克隆抗体,通过CRISPR/Cas9技术分别对creb1a和creb1b进行突变,分析其在卵子发生和精子发生中的具体作用。主要研究结果如下:1)ATF/CREB家族的起源与演化。本研究分离鉴定了22种代表性动物的ATF/CREB家族成员。在原始的多细胞动物中(如海绵动物、水母、丝盘虫和线虫),分离出了1-3个ATF/CREB成员;在环节动物、软体动物、节肢动物、原索动物和无颌脊椎动物中,分离到4-6个ATF/CREB成员;而在有颌脊椎动物,经历了第二轮全基因组复制(2R)的象鲨、腔棘鱼、斑点雀鳝和四足动物中,该家族成员的数量增加到12-14个;在经历了第三轮全基因组复制(3R)的真骨鱼中,ATF/CREB成员的数量增加到18-21个,而在鲤鱼这种经历了第四轮全基因组复制(4R)的物种中,ATF/CREB家族的扩张更为明显,总共分离到了30个ATF/CREB家族成员。系统进化分析表明该家族可能起源于原始的多细胞生物,伴随着全基因组复制,该家族在脊椎动物中发生了显著的扩张,大量的复制基因在真骨鱼中保留了下来。其中,atf6的复制起源于2R,而creb1、crem、jdp2、creb5、atf4、atf5和atf7的拷贝则是3R的产物。共线性分析表明,紧密排列的基因簇jdp2-batf和atf7-atf1分别在脊椎动物和辐鳍鱼类是高度保守的。2)ATF/CREB家族的表达模式分析。基于成体尼罗罗非鱼8个组织的转录组数据分析,在尼罗罗非鱼基因组中鉴定的21个ATF/CREB家族中的大多数成员在多个组织中都有表达,有12个、11个、9个、9个、7个、5个、5个和4个成员分别表达于精巢、头肾、脑、心脏、肝脏、卵巢、肾脏和肌肉。对尼罗罗非鱼雌雄性腺发育的四个关键时期(5、30、90和180 dah)(Days after hatching,dah)转录组数据分析发现,有19个成员在性腺中有表达,其中在5 dah时,creb1a、creb1b、jdp2b和atf5a呈现性二态表达;在90和180 dah时,creb1a、jdp2b、atf4b和atf5b在卵巢中高表达,而creb1b、creb5a、crema、cremb、atf1、atf4a和atf7a在精巢中高表达。这表明ATF/CREBs可能在性腺发育过程中具有重要功能。原位杂交验证了起源于3R的4对复制基因(creb1a、creb1b、crema、cremb、atf4a、atf4b、jdp2a和jdp2b)的表达,其结果与转录组一致。creb1a、creb1b和atf4a、atf4b在性腺中的表达发生了分化,creb1a和atf4a主要在卵巢I期和II期卵母细胞中表达,而creb1b和atf4b主要表达于精母细胞,这表明复制基因在进化过程中有可能发生了亚功能化。此外,免疫组织化学分析显示,Creb1b特异表达于精巢的初级和次级精母细胞,与原位杂交结果一致,表明Creb1b可以作为精母细胞的标记物。3)creb1a和creb1b对配子发生的影响。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别对尼罗罗非鱼creb1a和creb1b进行突变,现已分别获得cerb1a F0代突变鱼和creb1b纯合突变鱼。基因敲除的靶位点分别位于creb1a的第3个和creb1b的第2个外显子上,选择靠近原型间隔基序(Protospacer adjacent motif,PAM)区的限制性内切酶BsaJI和Nci I分别筛选creb1a和creb1b的F0代阳性突变鱼。用creb1b的F0代突变雄鱼与野生型雌鱼交配、酶切筛选、亚克隆测序获得F1代杂合突变鱼,选择删除5bp的杂合突变雌鱼和杂合突变雄鱼交配得到creb1b纯合突变鱼。性腺组织学分析显示,creb1a突变雌鱼卵母细胞退化,体细胞增多,而突变雄鱼精巢无明显表型。creb1b纯合突变雄鱼在90 dah时精巢出现空洞,精母细胞减少,后期精子发生正常,可育;纯合突变雌鱼卵母细胞退化,体细胞增多,Cyp19a1a的表达下调。结果表明creb1a参与了卵母细胞的发育,而creb1b同时在后期卵母细胞的发育和早期精子发生中起作用,但其他相似的蛋白可以补偿它在精子发生中的功能,使精子发生正常。综上所述,ATF/CREB家族可能起源于原始的多细胞动物,在经历了四轮全基因组复制以后该家族发生了显著的扩张。对整个家族表达模式的分析表明ATF/CREB家族大多数成员在多个组织中都有表达,一些成员在性腺中呈现差异表达。我们分别获得了creb1a和creb1b的突变鱼,发现creb1a只在卵子发生中起作用,而creb1b同时参与卵子发生和精子发生。本研究丰富了对ATF/CREB家族进化和表达的认知,为了解其潜在的功能,特别是在性腺发育和配子发生中的作用提供了新视角,对creb1的功能研究揭示了其在硬骨鱼类配子发生中的重要作用。