论文部分内容阅读
在发达国家，每年每十万人就有13-23人发生周围神经损伤，且损伤的发生会导致损伤部位运动、感觉和自主神经功能部分或全部丧失。周围神经损伤，特别是严重的损伤，即使通过手术进行损伤修复，也常面临再生神经修复效果不理想和功能恢复不完全的窘境。目前为止，自体神经移植仍然是神经移植的“金标准”。但是，由于自体神经来源有限且会造成新的创伤，使得自体神经移植受到很大的限制。然而想制备能够完全媲美自体神经的神经移植物却非常困难。所以，通过联合生长因子、营养因子和物理刺激等方法提高周围神经损伤修复效果不失为一种新选择。 课题组前期研究发现500 mW/cm2低强度超声刺激（Low-intensity ultrasound stimulation,LIPUS）处理可促进诱导性多潜能干细胞源性神经嵴干细胞（Induced pluripotent stem cells derived neural crest stem cells,iPSCs-NCSCs）增殖、提高iPSCs-NCSCs的活性和促进iPSCs-NCSCs向神经元及施旺细胞（Schwann cells,SCs）分化，在体研究进一步证实LIPUS联合iPSCs-NCSCs可更好地修复10 mm损伤的大鼠坐骨神经，但LIPUS促进iPSCs-NCSCs增殖和分化的分子机制仍不清楚。本研究首先通过高通量测序技术研究LIPUS对iPSCs-NCSCs基因表达的影响；其次，考察LIPUS促进iPSCs-NCSCs增殖和分化可能涉及的信号通路；最后，根据LIPUS引起的iPSCs-NCSCs基因表达的变化结果，考察在体条件下显著性差异表达基因，分析生长分化因子5（Growth differentiation factor5,GDF5）编码的蛋白促进联合LIPUS和iPSCs-NCSCs修复周围神经的效果。本文的主要研究内容和结果如下： ①基因表达谱分析LIPUS对iPSCs-NCSCs基因表达的影响 使用强度为500 mW/cm2的LIPUS处理iPSCs-NCSCs，而后利用Illumina HiSeq2000测序平台进行高通量测序，分析得到由LIPUS引起的iPSCs-NCSCs中具有显著性差异表达的基因。并对产生的这些显著性差异表达基因进行基因功能注释和富集、通路注释和富集分析。最后选取部分显著性差异表达基因，通过定量聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）就测序结果的准确性进行验证。研究结果表明：无论在iPSCs-NCSCs基础培养液培养条件下或神经元分化培养液培养条件下，LIPUS处理均能显著影响iPSCs-NCSCs基因表达。基础培养液培养条件下，共有76个显著性差异表达基因，神经元分化培养液培养条件下，有21个显著性差异表达基因。基因本体论（Gene Ontology,GO）注释分析发现基础培养液和神经元分化培养液培养条件下，LIPUS处理产生的显著性差异表达基因分别被注释到47和40个基因功能上。京都百科全书基因和基因组（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）注释发现基础培养液培养条件下，经LIPUS处理后的差异基因共注释到326条 KEGG通路上。神经元分化培养液培养条件下，经LIPUS处理后的差异表达基因共注释到323条KEGG通路上。选取部分显著性差异表达基因进行定量PCR验证，发现这些基因的表达趋势和测序结果基本一致。 ② LIPUS促进iPSCs-NCSCs增殖和分化的力学信号转导通路 使用强度为500 mW/cm2的LIPUS和黏着斑激酶（Focal adhesion kinase,FAK）抑制剂或细胞外信号调节激酶1/2（Extracellular signal-regulated kinases1 and2,ERK1/2）抑制剂处理iPSCs-NCSCs，检测LIPUS和FAK抑制剂或ERK1/2抑制剂处理对iPSCs-NCSCs增殖、分化以及骨架排列的影响，以考察 LIPUS对FAK-ERK1/2信号通路的影响。研究结果显示：FAK和ERK1/2抑制剂能够影响LIPUS对iPSCs-NCSCs增殖和分化的促进作用；LIPUS能促进iPSCs-NCSCs F-actin的表达，并且这种促进作用因 FAK或 ERK1/2抑制剂的使用而受到抑制；LIPUS能同时激活iPSCs-NCSCs的FAK和ERK1/2磷酸化，且添加相应的抑制剂处理会抑制磷酸化FAK和磷酸化ERK1/2的表达，添加抑制剂处理的同时添加LIPUS处理能缓解这种抑制作用。结果表明LIPUS处理能激活iPSCs-NCSCs的FAK-ERK1/2信号通路，且该通路很有可能直接或间接地参与了LIPUS促进iPSCs-NCSCs增殖、分化和骨架重排的调控。 ③ GDF5对LIPUS联合iPSCs-NCSCs修复周围神经损伤的影响 前述高通量测序发现LIPUS能显著性上调iPSCs-NCSCs的GDF5的基因表达水平，基于此，联合溶氧能力极强的全氟三丁胺（Perfluorotributylamine,PFTBA），在同种异体脱细胞神经支架上负载GDF5蛋白和PFTBA，通过大鼠坐骨神经损伤模型系统研究了载有iPSCs-NCSCs、iPSCs-NCSCs+PFTBA、iPSCs-NCSCs+GDF5和iPSCs-NCSCs+PFTBA+GDF5的同种异体脱细胞坐骨神经结合LIPUS处理对坐骨神经损伤修复的影响。体外实验结果表明5％的低氧培养条件下PFTBA能促进iPSCs-NCSCs的活性，联合LIPUS不能进一步提高PFTBA的促进作用；添加GDF5能促进iPSCs-NCSCs的神经分化，且随处理时间的延长，促分化作用有增强的趋势。在体研究结果表明LIPUS+iPSCs-NCSCs+PFTBA+GDF5具有最好的坐骨神经损伤修复效果。 综上所述，LIPUS处理会影响iPSCs-NCSCs的基因表达，并产生具有显著性差异表达的基因。LIPUS可能通过FAK-ERK1/2信号转导通路调控iPSCs-NCSCs的增殖、分化和骨架形态改变。LIPUS处理包含iPSCs-NCSCs+PFTBA+GDF5的同种异体脱细胞神经导管支架具有很好的促坐骨神经损伤修复的效果。本文结果不仅在一定程度上揭示了LIPUS影响细胞行为的作用机制，并且为LIPUS在周围神经组织修复领域的应用和发展提供了理论依据。