【摘 要】
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目的:观察恩替卡韦（Entecavir,ETV）联合龙柴方对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒DNA（hepatitis B virus,HBV DNA）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）含量的变化以及对P-糖蛋白（P-gp）、同源性磷酸酶-张力蛋白（PETN）及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路相关蛋白的影响,探讨龙柴方对ETV抗
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目的:观察恩替卡韦（Entecavir,ETV）联合龙柴方对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒DNA（hepatitis B virus,HBV DNA）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）含量的变化以及对P-糖蛋白（P-gp）、同源性磷酸酶-张力蛋白（PETN）及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号通路相关蛋白的影响,探讨龙柴方对ETV抗HBV产生增效作用的机制。方法:①含药血清的制备:龙柴方低、中、高剂量组（9.84g/kg、19.68g/kg、39.36g/kg）。②ETV母液配制:浓度为40mg/mL。③HepG2.2.15细胞培养与传代,将同一代数HepG2.2.15细胞,分空白对照组（等量培养基）、正常血清组（正常血清）、ETV组（ETV稀释液）、ETV+龙柴方低、中、高剂量组（相应含药血清）干预HepG2.2.15细胞,予细胞培养24小时。④MTT 比色法（MTT）检测对比各组HepG2.2.15细胞存活率;实时荧光定量PCR（Q-PCR）法检测各组HBVDNA含量的影响;酶联反应吸附实验（ELISA）检测各组细胞上清液HBsAg、HBeAg含量;蛋白质印迹法（Western blot）检测各组细胞MDR1（P-gp）、AKT、PI3K和PTEN蛋白表达变化。结果:①MTT法检测各组细胞存活率,组间OD值差异无统计学意义（P＞0.05）。②HBV DNA含量:与空白对照组相比,ETV组(（P＜0.05）、ETV+龙柴方低剂量组（P＜0.01）及ETV+龙柴方中剂量组（P＜0.001）HBV DNA含量均下降,说明龙柴方低、中剂量组抗HBV作用增强。③HBeAg含量:与空白对照组相比,ETV组及ETV+龙柴方低、中、高剂量组HBsAg含量均显著下降（P＜0.001）,以ETV+龙柴方中剂量组效果最佳;HBsAg含量:与空白对照组相比,仅ETV+龙柴方中剂量组HBeAg含量下降（P＜0.05）,其余各组无显著性差异（P＞0.05）;显示龙柴方中剂量组抗HBV增效作用效果最佳。④P-gp及PI3K/AKT通路蛋白表达:与空白对照组相比,正常血清组及ETV组蛋白表达量均无明显差异（P＞0.05）,而ETV+龙柴方中剂量组上调了 PTEN蛋白（P＜0.05）,显著下调了AKT蛋白、PI3K蛋白和P-gp蛋白（P＜0.01和P＜0.001）;ETV+龙柴方低剂量组表现次之。结论:ETV联合龙柴方后,能增强对HBV DNA的抑制作用,降低HBsAg、HBeAg分泌,能上调PETN蛋白含量,下调P-gp及PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。结果认为,ETV联合龙柴方后的抗HBV增效作用与调控P-gp及上调PETN蛋白以及PI3K/AKT信号通路蛋白的表达的分子机制相关,其结果在一定程度上解释了龙柴方对ETV抗HBV产生增效效应作用的部分机制。至于如何调控信号通路蛋白的微靶点,有待进一步深入研究。
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