目的:　　 钙激活蛋白43(calcium activated protein43,Cap43)基因又名N-myc下游调控基因-1(N-myc downstreamraguglatedgene1,NDRGl),是美国纽约大学MaxCostA研究组ZhouD与SalnikowK于1998年在研究镍化合物致癌机理中发现的人类新基因,其mRNA大小为3000bp,编码394个氨基酸残基,相对分子质量为43000。Cap43基因,由镍化合物特异性诱导,其蛋白表达于胞浆,具有镍特异性结合位点片断。Cap43基因表达水平的高低与镍化合物作用的时间及作用剂量的强度有时间剂量上的依赖性。Cap43基因在镍化合物所诱导的肺癌细胞系中转录、表达水平超过正常细胞30倍,其mRNA非常稳定,并且为肺癌发生、发展的早期事件之一;Cap43蛋白在肺癌细胞或组织中呈高度稳定表达,而在正常细胞或组织中不表达或呈极低表达。　　 PI3K/Akt/mTOR是与细胞增殖和细胞凋亡关系最密切的信号传导通路之一,在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。干扰PI3K-Akt-mTOR信号传导途径可以影响肿瘤细胞的转移和浸润,这一途径中的任一关键分子都可以作为潜在的治疗靶点。PI3K(磷脂酰肌醇-3羟基激酶pho-phati-dylinositol3kinase)是一个酯酶,其上游存在着RTKs(受体酪氨酸激酶,receptortyrosinekinase)/Ras(大鼠肉瘤,ratsarcoma,原癌基因C-ras的表达产物)信号通路,当细胞受生长因子等刺激因子刺激后,细胞内PI3K活化,进而磷酸化其底物PIP2(3,4二磷酸磷脂酰肌醇,phosphatidylino-sitol-3,4-biphosphate),使其转化为PIP3(3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇,phosphati-dylinositlo3,4,5-trisphosphate),并可活化下游Akt。Akt(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,protein-serine-threonine),又称PKB(蛋白激酶B,proteinkinaseB),通过血小板-白细胞C激酶同源区和PIP3结合,并通过PDK1、PDK2(磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶,phosphoinositide-Dependent-proteinkinase,PDK)使第308位上的苏氨酸位点(Thr308)和第473位上的丝氨酸位点(Ser473)磷酸化而被激活。活化的PI3K/Akt可能是通过TSC1/TSC2复合物(tuberoussclerosiscomplex,TSC)进一步激活其下游分子mTOR。mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶向基因,mammaliantargetofrapamycin)又称FRAP(FK506-bindingprotein12andrapamycinassociatedprotein),是一种不典型的丝氨酸/苏氨酸激酶,由于其羧基末端与PI3K催化区高度同源,mTOR被认为是PI3K相关的蛋白激酶家族成员。mTOR可随后磷酸化它的两个下游分子,即翻译抑制分子eIF-4E(真核翻译起始因子4E,eukaryotictranslationinitiationfactor4E)结合蛋白1(4E-BP1)和p70S6K磷酸化后激活其功能,同样促进蛋白质的合成。因此,PI3K/Akt/mTOR被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路,参与细胞增殖、分化、迁移等的调节。亦有研究结果显示,PI3K/Akt/mTOR信号传导通路可能参与对HIF-1(缺氧诱导因子,hypoxiainduciblefactor-1)表达和活性的调控,但在不同的细胞类型以及不同的实验条件下又存在一定的差异。如果抑制mTOR的功能,理论上应该消除PI3K/Akt通路介导的增殖信号,使细胞周期阻滞,抑制肿瘤生长;针对镍特异诱导Cap43高表中HIF-1所起的作用,如果抑制mTOR的功能,将使HIF-1表达下降,因而Cap43表达也应下降或极低表达。　　 RNA干扰(RNAinterference,RNAi)也称转录后基因静默(posttran-scriptionalgenesilencing,PTGS),是由双链RNA诱导的、能在细胞内有效地抑制有互补序列内源性基因的现象。它主要通过21-23nt的双链或发夹状RNA与特异性mRNA的结合导致靶基因的降解,进而导致目的蛋白表达下调。目前在研究哺乳动物细胞的基因功能方面,所产生RNAi效应主要应用两条途径:一是通过体外转录或化学合成小分子干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)介导RNAi作用;二是通过短发央式RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达载体转染细胞后所表达的shRNA诱导RNAi作用。化学合成的siRNA抑制作用时间短,成本昂贵,并且易被RNA酶污染降解;而shRNA表达载体转染细胞后所表达shRNA成本较低,可在细胞内RNA酶的作用下被切割成与体外合成的siRNA相同的序列与结构,诱导RNAi。同时,由于它可自身复制,所以它可以稳定持续地表达,使RNAi作用时间更长、更稳定。慢病毒载体是一种复制缺陷型逆转录病毒载体,用慢病毒载体介导RNAi作用持久,并可以扩大载体感染细胞的范围,因此近年来慢病毒载体作为基因治疗载体被广泛应用。显然,用shRNA技术敲低mTOR的表达,比用对mTOR有较强特异性抑制作用的Rapamycin、CCI-779和RAD001等药物抑制mTOR的表达更有安全性和科研意义。　　 由于,镍致癌以致肺癌为主,为此我们首先建立了一种双抗夹心ELISA方法;并应用S-P(链霉素生物素蛋白.过氧化物酶连结法,streptavidin-perosidase)染色技术,检测非接触镍的肺癌患者血清以及相应的肿瘤组织中Cap43的表达状况,分析不同病理类型肺癌组织中Cap43蛋白的分布特征;分析扩大样本以后的前项试验结果的稳定性和Cap43蛋白表达与肿瘤病理类型和分期的关系;运用shRNA表达载体转染细胞的方法对PI3K/Akt/mTOR信号传导途径进行干扰,从而检测mTOR敲减的靶细胞中Cap43表达情况及mTOR敲减的靶细胞的增殖活性和细胞数量的变化;分析shRNA干扰mTOR途径阻碍Cap43生成与镍化合物的关系。本研究将为评价Cap43作为肺腺癌肿瘤标志物的可行性及作用机制,进一步完善PI3K/Akt/mTOR细胞信号传导通路提供科学依据。　　 方法:　　 1、双抗夹心ELISA方法对91例患者血清中Cap43的表达状况进行初步定性检测;采用S-P染色技术对91例不同组织学类型的肺癌石蜡组织标本中Cap43蛋白表达状况及分布特征进行检测;分析Cap43蛋白表达与病理分期的关系。　　 2、利用RNAi技术,设计合成针对mTOR基因的shRNA,逆转录病毒构建shRNA表达的慢病毒载体。RealtimeRT-PCR及WesternBlot筛选有效抑制mTOR的靶点,提取稳定表达的细胞株,实验验证mTORshRNA干扰作用的特异性。　　 3、实验随机分为单纯人肺腺癌细胞A549组、人肺腺癌细胞A549+镍转化+rapamycin(mTOR抑制剂)组、人肺腺癌细胞A549+镍转化组、人肺腺癌细胞A549+镍转化+shRNA干扰mTOR组。MTT法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪测定细胞的周期,AnnexinV/PI法检测细胞的凋亡情况。RealtimeRT-PCR法分析各组细胞中Cap43mRNA和mTORmRNA的表达情况;WesternBlot法分析Cap43和mTOR蛋白的表达情况。　　 4、统计学分析:实验数据以均值±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件包,各组之间的差异性比较应用单因素方差分析进行检验,用Spearman和Pearson进行相关性分析,P＜0.05视为有统计学意义。　　 结果:　　 1、ELISA检测阳性率为80.22%,敏感度(SE)为84.51%,特异度(SP)为35.00%,阳性预测值(PV+)为82.19%,阴性预测值(PV-)为38.89%,实验结果与病理诊断的符合率为73.63%。经X2检验得两种检验方法无明显差异。　　 2、免疫组化方法发现Cap43阳性细胞主要分布于肺腺癌肿瘤细胞浸润区,阳性颗粒定位于肿瘤细胞的胞核/胞内;Cap43阳性细胞也同样分布于肺鳞癌肿瘤细胞浸润区,阳性颗粒定位于肿瘤细胞的胞浆/胞内。　　 3、realtimePCR回复验证分析结果显示,未感染慢病毒的细胞空白对照mTORmRNA的相对表达水平高于针对目的基因的RNAi靶点慢病毒感染组;阴性对照病毒感染的细胞组mTORmRNA的相对表达水平也高于针对目的基因的RNAi靶点慢病毒感染组。WesternBlot实验结果显示,阴性对照病毒感染的细胞组mTOR蛋白的表达水平高于针对目的基因的RNAi靶点慢病毒感染组的蛋白表达水平。　　 4、10mg/L浓度组对A549细胞的抑制率达50.62%,各刺激因素组细胞的抑制率与单纯A549组比较,差异均显著。流式细胞仪检测结果显示,与单纯A549组相比,镍转化组Go/G1期细胞增加,S期细胞比例减少;镍转化+雷帕霉素组、镍转化+shRNA干扰mTOR组也出现Go/G1期细胞增加,S期细胞比例减少,发生了G1/S期细胞周期阻滞,且与单纯A549组相比差异显著。不同刺激因素组细胞的凋亡率与单纯A549细胞组相比较,也均具有显著差异;镍转化+雷帕霉素组、镍转化+shRNA干扰mTOR组与镍转化组比较,均有统计学差异。　　 5、realtimePCR和Westernblot分析显示,Cap43的表达水平,镍转化组均高于单纯A549组和镍转化+雷帕霉素组、镍转化+shRNA干扰mTOR组。mTOR的蛋白表达水平,镍转化组高于单纯.A549组,差异显著;镍转化+雷帕霉素组和镍转化+shRNA干扰mTOR组均低于单纯A549组和镍转化组,差异均有统计学意义。　　 结论:　　 1、肺腺癌Cap43含量与肺鳞癌Cap43含量均与分化程度相关,即分化程度越低,Cap43含量越高;肺腺癌与肺鳞癌Cap43阳性细胞主要分布于肿瘤细胞浸润区,肺腺癌阳性颗粒主要定位于肿瘤细胞的胞核;肺鳞癌阳性颗粒主要定位于肿瘤细胞的胞浆;两者作用机制可能不同;　　 2、从puromycin筛选观察结果可见:目的细胞的感染效率达到80%以上;Realtime-PCR结果显示:A549细胞中,针对目的基因的RNAi靶点慢病毒感染组对mTOR基因的敲减效率达到70%,WesternBlot结果显示,针对目的基因的RNAi靶点慢病毒感染组靶点对A549细胞mTOR的表达有敲减效果;　　 3、shRNA干扰组细胞的增殖作用明显被抑制;干扰mTOR信号通路可以影响细胞进入DNA复制期;mTOR的活性被抑制会诱导细胞发生凋亡;镍诱导了Cap43的生成,雷帕霉素和干扰mTOR信号通路则阻碍了Cap43和mTOR的表达。