论文部分内容阅读
Rho GTPases包括RhoA、Rac1和Cdc42等，作为分子开关，接受胞外刺激信号后，从联结GDP的失活状态，转为联结GTP的激活状态，与其下游效应分子相互作用，启动一系列胞内信号转导通路，从而调节细胞形态、迁移，细胞生长、增殖，细胞凋亡，转录激活等许多重要的生理过程，可直接影响某些疾病的产生，如肿瘤的发生，转移等。FRET对于荧光基团的相对距离(小于10nm)和空间取向高度敏感，通过FRET效率的测量，观察生物大分子间相互作用的改变情况，从而研究其构象变化与相互作用。更重要的是，采用这种技术，无需破碎细胞或对细胞造成损伤，可在活细胞生理条件下，实时、定量地对细胞内蛋白-蛋白间，如配基与受体，信号分子与效应分子的相互作用进行动态研究。
本文以PCR方法从人脑cDNA基因文库内扩增了Rac1、Cdc42cDNA基因全序列，及其效应蛋白基因Pak1、N-WASP的GTP酶联结区域(GBD)序列，从dsRedl-N1质粒中扩增dsRed1红色荧光蛋白全基因序列。将上述基因定向克隆至pECFP-N1质粒载体，获得包含dsRed1，Pak1或N-WASP的GBD，Rac1或Cdc42，ECFP的基于FRET原理的胞质表达单分子探针，在此基础上，在dsRed1的C末端加入一段CAAM法尼基化基序，构建包含EGFP，Pak1的GBD，Rac或Cdc42，dsRed1-CAAM的质膜特异表达的单分子探针。离体荧光光谱检测表明，在转染动物细胞中产生了FRET现象。诱导5min的活细胞中，FRET效率最高。随着诱导时间的延长，FRET效率缓慢下降。采用这两种探针，可用于监测活细胞中诱导激活Rac1、Cdc42信号转导通路的3D时空图像以加深对Rho GTPases信号传导过程的理解，建立细胞内信号传导过程，与细胞形态学变化之间的联系，以及检测待测蛋白分子的GEF或GAP活性。